金属硫蛋白（MT）作为一种重要的抗氧化蛋白，在炎症性疾病和癌症中发挥着重要作用。MT-2（MT的一个亚型）的表达被证明可以有效抑制细胞的凋亡、转录因子的调节以及活性氧的清除，这将有助于癌细胞的存活、增殖以及对氧化应激产生抗性。更重要的是，MT-2水平的升高往往与肿瘤的进展与耐药性密切相关。因此，靶向MT-2有望引起肿瘤细胞内的抗氧化系统的崩溃，进而用于肿瘤细胞的清除。
有鉴于此，吉林大学口腔医院/白求恩口腔医学院的孙宏晨教授、李道伟副教授以及中国科学院长春应用化学研究所的王欢博士（共同通讯作者）报道了一种铜掺杂的碳点（Cu-CDs），其可以通过阻断MT-2的表达用于抗肿瘤治疗。
相关成果以标题为Blocking Metallothionein-2 Expression by Copper-Doped Carbon Dots Induces Cellular Antioxidant System Collapse for Antitumor Therapy发表在《Nano Letters》上。论文的共同第一作者为吉林大学口腔医院的硕士研究生刘珂萱与博士研究生刘欣辰。
Cu-CDs 是通过乙二胺四乙酸二钠铜水合物在250°C下反应120分钟制备的。TEM图像表明，Cu-CDs 的平均粒径为1.74nm（图 1a）。随后，高分辨XPS用来详细研究了Cu-CDs中C、N、Cu和O元素的化学状态。如图 1b 和 1f 所示，在 Cu-CDs 上可以观察到大量的C−O/C-N、C=O/C=N和O=C−O物种，这些物种是在碳化过程中形成的。与其他N掺杂的碳点一样，在Cu-CDs的N 1s XPS光谱中可以观察到包括吡啶氮、吡咯氮和氨基氮在内的含N结构（图 1c）。如图 1e 所示，Cu 2p XPS 光谱表明Cu-CDs上存在Cu(II)。此外，紫外-可见光谱表明Cu-CDs表现出较宽的光谱吸收（图 1d）。Cu-CDs 的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表明，在 1000−1080 cm−1 范围内的峰可归因于 N−Cu−N 伸缩振动，表明了Cu-N配位结构的存在。与其他碳点类似，这些Cu-CDs表现出了激发依赖的光致发光特性（图 1i）。此外，通过ICP-MS分析，Cu-CDs中Cu的含量为 0.441 wt％。为了使 Cu-CDs 在体内具有相对较长的循环时间，其进一步被聚乙二醇（PEG）进行非共价修饰。
图1. Cu-CDs的相关结构表征。
Cu-CDs的生物分布情况进一步通过荧光成像进行了分析。将Cy5标记的Cu-CDs静脉注射到4T1荷瘤小鼠体内。如图2a和2b所示，静脉注射后，在身体的各个部位都可以检测到荧光信号，平均荧光强度随着时间的推移逐渐降低。值得注意的是，肿瘤内Cu-CDs的荧光强度下降较慢，这可能是由于Cu-CDs的EPR效应（图 2c）。此外，即使在注射后72小时，Cy5标记的Cu-CDs在肿瘤内的荧光信号仍高度可检测。因此，在抗肿瘤实验中，作者每3天对4T1荷瘤小鼠进行一次给药，以确保Cu-CDs在肿瘤中有效积累（图 3a）。此外，在整个实验期间，大多数Cu-CDs仍留在肾脏中，而其他器官的荧光信号随时间下降，表明Cu-CDs的主要清除途径是肾脏（图2d）。另外，离体成像显示，给药后6和24小时肝脏荧光显著降低，同时6小时时肺部荧光短暂升高。此外，24小时内胃肠道系统荧光强度的变化表明Cu-CDs可能通过肝脏清除和随后的胆汁排泄。这种现象归因于肠肝循环，即肠道通过胆管和门静脉与肝脏相连。Cu-CDs在肝脏和肾脏的富集特征表明在碳点治疗期间这两个器官的负担增加，需要关注和监测肝肾功能以确保安全。
图2. Cu-CDs经尾静脉注射后在小鼠体内的组织分布情况。
4T1荷瘤小鼠每3天静脉注射一次Cu-CDs，剂量为50mg/kg，而对照组被注射等体积的生理盐水。根据肿瘤体积评估Cu-CDs的抗肿瘤活性（图 3a和3e）。值得注意的是，Cu-CDs表现出显著的肿瘤抑制活性，抑制率约为 56.3%（图3e）。苏木精和伊红（H＆E）染色的组织学分析显示，Cu-CDs组肿瘤组织内的核碎片数量更多，表明肿瘤细胞的坏死（图 3f）。通过使用Ki67免疫组化评估肿瘤细胞的增殖。图3h显示，Cu-CDs组中Ki67阳性细胞较少，表明肿瘤细胞增殖减少。此外，如TUNEL染色图像所示，Cu-CDs组显示出高水平的细胞凋亡（图 3i）。这些结果证实了Cu-CDs的肿瘤抑制作用。此外，Cu-CDs的给药对小鼠体重无显著影响，表明Cu-CDs具有良好的生物相容性（图 3d）。而且，Cu-CDs组和对照组主要器官的 H＆E 染色图像表明 Cu-CDs 的总体生物安全性（图 3g）。为了了解Cu-CDs的抗肿瘤机制，作者对上述实验中的肿瘤组织进行了转录组测序研究。共鉴定出966个差异基因，包括126个上调基因和840个下调基因。在下调基因中，MT-2A下降最为显著，减少了2344.51 TPM（图 4a）。值得注意的是，在对照组中，MT-2A 的表达水平高达4652.72 TPM，表明肿瘤中的氧化还原水平较高。在人类中，MT-2A主要在MT基因家族中表达。作者还观察到MT-1下降了2017.57 TPM。在上调基因中，ApoE增加最为显著，增加了 1867.18 TPM（图 4e）。先前的研究发现，ApoE是MT-2水平下调的重要决定因素。因此，作者假设Cu-CDs通过上调ApoE抑制MT-2表达来抑制肿瘤生长。
图3. Cu-CDs在肿瘤治疗中的应用及效果。
转录组测序结果确定ApoE/MT-2轴是Cu-CDs的作用靶点。随后，作者通过一系列体内和体外实验，证实了Cu-CDs对细胞内MT-2和ApoE表达的影响以及它们之间的内在相互作用。采用实时定量PCR评估Cu-CDs处理的4T1细胞中MT-2 mRNA水平（图 4c）。研究结果显示，在50 μg/mL的Cu-CDs处理 48 小时后，MT-2 mRNA水平显著降低约48.6%。此外，作者评估了Cu-CDs在体内和体外样本中对 MT-2 蛋白表达的影响。对肿瘤切片进行免疫组化染色，并使用ImageJ软件对MT-2表达进行定量（图 4b）。结果表明，Cu-CDs组的MT-2水平与对照组相比降低了约34.5倍，表明体内Cu-CDs诱导了MT-2表达下调。此外，利用蛋白质印迹法（WB）来确认Cu-CDs阻断MT-2表达的效果。用25 μg/mL的Cu-CDs处理48小时后，4T1细胞中的MT-2蛋白水平部分下调。将Cu-CDs浓度提高到50 μg/mL导致MT-2蛋白水平降低约63.9%。这些WB结果进一步支持了Cu-CDs能够有效阻断MT-2 表达（图 4d）。此外，实时定量PCR和WB分析证实Cu-CDs显著上调了 ApoE（图4f和4g）。ApoE与衰老和年龄相关疾病高度相关，并与氧化应激和慢性炎症有关。为了确定MT-2是否与ApoE有关联，作者在4T1细胞中敲低了ApoE。通过免疫荧光分析、定量实时PCR和WB评估转染效率（图 4h）。免疫荧光染色表明，MT-2的下调是由于ApoE的上调，因为敲低ApoE减轻了这种效应（图 4i）。作者的结果与之前的一项研究一致，该研究表明ApoE是MT-2水平下调的重要决定因素，同时伴有核因子红细胞2相关因子（NRF）的降低。因此，这些结果表明，Cu-CDs通过ApoE/MT-2轴诱导细胞抗氧化系统崩溃，同时伴有NRF2的降低。
图4. Cu-CDs通过上调载脂蛋白E（ApoE），从而有效阻断MT-2的表达。
为进一步评估阻断MT-2对抗氧化系统和肿瘤细胞存活的影响，将Cu-CDs与4T1、Cal 27和正常的hDPSCs一起培养。Cu-CDs以浓度依赖性方式诱导显著的细胞死亡。当用50 μg/mL的Cu-CDs培养 48 小时时，4T1 细胞的细胞活力降至19.8%，Cal 27细胞的细胞活力降至48.9%。钙黄绿素AM/PI染色测定证实了50 μg/mL 的Cu-CDs对4T1和Cal 27细胞均具有明显的细胞毒性（图 5a和图 5c）。随着Cu-CDs浓度的增加，4T1细胞中的氧化还原平衡被破坏，表现为GSH表达水平显著下降，同时ROS水平升高。在暴露于12.5 μg/mL 的Cu-CDs 48小时后，4T1细胞中的GSH水平下降了约66.1%。用 25 μg/mL的Cu-CDs处理导致更大的降低，GSH水平下降了约 86.1%。GSH 的消耗与升高的 ROS 水平相对应，表明4T1细胞中的氧化应激水平增加。然后，作者使用脂质过氧化探针C11-BODIPY来监测脂质ROS水平的变化。如图5b和图5d所示，随着Cu-CDs浓度的增加，4T1和Cal 27细胞内的脂质ROS水平显著增加。为了证实Cu-CDs通过诱导氧化应激和破坏氧化还原平衡来诱导肿瘤细胞死亡，作者研究了在肿瘤细胞用Cu-CDs处理时，铜螯合剂四乙烯五胺（TEPA）和ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）对细胞活力的影响。如预期的一样，TEPA和NAC都能显著逆转细胞活力。此外，TEPA和NAC还可以恢复肿瘤细胞的细胞内氧化还原平衡，表现为ROS水平降低、GSH水平升高以及脂质ROS水平降低。为了证明正常细胞具有足够的抗氧化储备来抵御Cu-CDs诱导的外部ROS应激，作者使用了人类牙髓干细胞（hDPSCs）进行实验。结果表明，用50 μg/mL的Cu-CDs处理时，hDPSCs保持了86.8%的细胞存活率，突出了Cu-CDs的安全性。同时，hDPSCs中MT-2的表达变化不显著，用50 μg/mL的Cu-CDs处理后，hDPSCs中的GSH水平下降了约33.8%。先前的研究表明，GSH和MT-2通过不同的机制清除ROS。MT-2在清除自由基方面发挥作用，反映了与GSH不同的细胞抗氧化特性。值得注意的是，细胞内抗氧化系统的组成部分相互关联且相互依赖。在应对升高的ROS水平时，细胞调动多种抗氧化机制来维持氧化还原稳态。总的来说，作者得出结论，Cu-CDs通过ApoE/MT-2轴破坏和破坏抗氧化系统来促进细胞内ROS的产生，最终诱导肿瘤细胞死亡。
图5. Cu-CDs以剂量依赖的方式诱导细胞内ROS的产生。
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https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.4c03418
