药效团杂交一直被认为是药物化学领域实现改善治疗效果的一种有效方法，即通过将具有不同但协同生物活性的两个独立药效团整合到一个新的杂交骨架中。通过将已知药物的药理学活性结构融合在一起，这种方法在治疗细菌感染、病毒感染、疟疾以及癌症等疾病方面显示出了巨大的潜力，以克服药物耐药性或提高母体药物的药理学效能。重要的是，具有双重作用机制的杂交药物在拥有单一的药代动力学特征的同时，避免了母体药物在药代动力学、药物-药物相互作用和不良反应方面的差异，从而在与两种不同母体药物的联合用药相比时显示出了独有的药代动力学优势。然而，小分子杂交药物存在着水溶性差、体内保留时间短和特异性低等缺陷。
在药物开发中，这样的困境可以通过借鉴专注于药物递送的纳米医学原理来克服。然而，用于药物递送的纳米载体通常由于有限的负载能力和复杂的药物-载体相互作用而引发安全方面的担忧。最近，通过分子自组装策略构筑的药物自递送系统可以实现无需额外纳米载体的药物组合递送。然而，生物稳定性不足的问题仍然存在。因此，迫切需要有效的替代策略来构建具有协同生物活性的纳米药物，以实现高效的疾病治疗效果。碳量子点因其广泛的来源、高生物稳定性、无毒性和长效体内保留的特性，在纳米医学领域备受关注。重要的是，碳量子点的内核结构和表面功能基团都具有明显的前体依赖性和多样性，使得巧妙设计的碳量子点具有多种多样的物理化学性质和功能。
鉴于药物化学中的药效团杂交原理和碳量子点材料的合成原则，中国科学院长春应用化学研究所的任劲松研究员/曲晓刚研究员（共同通讯作者）和王欢博士（第一作者）提出了一种基于碳量子点的药效团杂交策略，以构建一种具有协同药效的药物，用于黑色素瘤的高效治疗。通过将SLC7A11（肿瘤内一个重要的抗氧化防御系统）的药理学抑制剂和共成核前体在结构上杂交形成碳量子点，获得杂交型纳米药物（SCACDs）。这些SCACDs具有双重增强的生物活性，包括由SCACDs中内核结构适当的能带结构而赋予的优越的声催化活性，以及由表面药物活性基团所赋予的极高的SLC7A11抑制活性。在小鼠黑色素瘤模型上，SCACDs具有较长的体内保留时间和理想的生物分布，可以在极低的注射剂量下消除黑色素瘤细胞。
本研究提供了一种可行且有效的策略，用于开发具有协同药效的纳米药物，以实现显著提高的治疗效果。相关成果以标题为A Nanocarbon-Enabled Hybridization Strategy to Construct Pharmacologically Cooperative Therapeutics for Augmented Anticancer Efficacy发表在化学期刊《Chemical Science》上。
图1. SCACDs的合成与性质。
SCACDs通过在氢氧化铵的条件下，由SLC7A11抑制剂柳氮磺胺吡啶与共成核前体柠檬酸制备而成。如图1c所示，材料的尺寸约为2.44纳米。图2a中可以看出，SCACDs具有碳量子点典型的特征红外光谱。X射线衍射谱和拉曼光谱也证实了石墨相结构的生成（图2b，c）。基于热重曲线可以看出，SCACDs展示出了与前体分子完全不同的质量损失（图2d）。X射线光电子能谱证实了柳氮磺胺吡啶的含N结构和含S结构在SCACDs上得到了有效保留。此外，柠檬酸的碳谱和氧谱的相关结构变化也证明了碳化过程的发生（图2e-h）。MALDI-TOF分析证实，SCACDs的分子量约为1300~5000（图2i）。此外，SCACDs具有良好的荧光特性（图2j，k）。
图2. SCACDs的结构表征。
随后，密度泛函理论计算（DFT）和固体核磁共振技术以及紫外-可见吸收光谱用以进一步表征SCACDs的精确结构。通过在实验反应温度（473 K）下反应整个反应过程，获得了SCACDs的理论结构，并进一步对其固体核磁共振碳谱和紫外-可见吸收光谱进行模拟。研究发现，所得理论结构的固体核磁共振碳谱和紫外-可见吸收光谱与实验测得结构高度相似，证实了SCACDs是由N掺杂的碳量子点表面连接了柳氮磺胺吡啶的药效团所构成（图3）。上述技术的联合使用为破译碳量子点的结构开拓了新的途径。
图3. SCACDs的理论结构及其理论谱图与实验谱图。
接下来，SCACDs的声催化活性通过电子自旋共振技术进行分析。通过使用DMPO和TEMP捕获剂对在超声条件下，SCACDs产生超氧阴离子和单线态氧的能力进行测定。如图4a-g所示，SCACDs在超声照射下具有极高的活性氧产生能力，且在相同的实验条件下，产生超氧阴离子和单线态氧的能力比商用的P25二氧化碳声催化剂分别提高了266.9%和570.4%。此外，通过固体紫外可见光谱tauc plot曲线和莫特-肖特基曲线分析，得知SCACDs的价带与导带的位置分别为0.527 V和-0.993 V（图4h-l）。较窄的能带结构和距离单线态氧与超氧阴离子的氧化还原电位更近的能带位置是其具有超高声催化活性的原因。由于SCACDs的价带位置距离单线态氧的氧化电位非常近，SCACDs具有极高的单线态氧生成能力。
图4. SCACDs的声催化活性测试。
为提高材料的生物稳定性，SCACDs进一步通过非共价形式修饰了聚乙二醇。图1d中的照片显示，聚乙二醇化的SCACDs在水中、PBS中以及含有10%胎牛血清的DMEM中都具有极好的分散性。为方便起见，在接下来的生物研究中将聚乙二醇化的SCACDs也简称为SCACDs。随后，作者选择黑色素瘤细胞系B16F10作为后续体外研究的典型细胞系，以研究SCACDs的药理学活性。作者首先研究了SCACDs处理的黑色素瘤细胞的胱氨酸摄取情况。图5a显示，与SCACDs共孵育后，黑色素瘤细胞的胱氨酸摄取显著减少，表明xCT抗氧化机制已被抑制。在相同的柳氮磺胺吡啶药效团的剂量下，SCACDs在抑制xCT功能方面的活性比小分子柳氮磺胺吡啶高出数倍。图5b、c展示了SCACDs处理的黑色素瘤细胞的胞内GSH水平。如图5b所示，SCACDs可以有效地降低细胞内GSH水平。在相同的药效团剂量下，SCACDs能够以高出柳氮磺胺吡啶1520.01%的效率耗竭细胞内的GSH（图5b）。由于增强了xCT的抑制活性，SCACDs处理的B16F10细胞中可观察到显著增加的活性氧水平（图5d）。上述结果表明，SCACDs在细胞层面可极大地增强柳氮磺胺吡啶的药理学活性，这可归因于SCACDs有效的细胞摄取。如图5e所示，Cy5标记的SCACDs（Cy5-SCACDs）可以被B16F10细胞有效摄取。以前的研究已经证明，xCT介导的胱氨酸摄取促进了细胞内GSH和GPX4的生物合成。事实上，如图5f, g所示，SCACDs可有效地降低B16F10细胞中GPX4的表达水平。这些结果明确表明了SCACDs的xCT抑制能力。通常来说，xCT药物抑制剂，如柳氮磺胺吡啶，会通过促进Beclin 1-SLC7A11复合物的形成来发挥药理学作用（图1a）。如图5f、g所示，SCACDs能够有效诱导自噬标志物LC3B-I转化为LC3B-II。同时，在用SCACDs处理后，免疫沉淀实验结果显示Beclin 1与SLC7A11之间的相互作用有所增加。值得注意的是，与柳氮磺胺吡啶相比，SCACDs显示出显著提高的生物活性。
图5. SCACDs在细胞层面抑制SLC7A11的性能。
作者进一步在细胞层面研究了SCACDs的声动力抗肿瘤效果。B16F10细胞被随机分为六组，分别命名为对照组、柳氮磺胺吡啶组、SCACDs组、超声组、TiO2+超声组和SCACDs+超声组。如图6a、b所示，在超声波的照射下，SCACDs+超声组的抗肿瘤活性明显高于对照组、超声组、柳氮磺胺吡啶组、SCACDs组和TiO2+超声组，这是由于SCACDs具有较高的声催化活性以及增强的xCT抑制活性（图6b）。如图6c所示，SCACDs对正常细胞HaCat细胞的毒性低于对B16F10细胞的毒性，这可能是由于癌细胞已经产生了较高的xCT水平，使其对xCT抗氧化机制的干扰更加敏感。因此，SCACDs对黑色素瘤细胞表现出了选择性毒性。如图5d所示，SCACDs在超声照射下的可以在细胞内产生大量的活性氧。如图6d所示，与其他实验组相比，SCACDs+超声组的B16F10细胞形成的克隆明显较少，这表明SCACDs具有很高的抗增殖能力。SCACDs的抗肿瘤活性进一步通过Annexin V-FITC/PI凋亡检测（图6e）得到证实。此外，通过Western blot分析，作者进一步研究了在超声照射下SCACDs处理的B16F10细胞中caspase 3和PARP在内的凋亡标志物的表达情况。如图6f所示，B16F10细胞通过凋亡过程被SCACDs杀死。
图6. SCACDs的抗肿瘤活性。
作者最后详细研究了SCACDs在体内的抗肿瘤效果。将C57BL/6荷瘤小鼠分为五组，分别为对照组、超声组、柳氮磺胺吡啶（6 mg/kg）组、SCACDs（6 mg/kg）组和SCACDs（6 mg/kg）+ 超声组。在静脉注射SCACDs后12 h、36 h和60 h时，对肿瘤进行超声波照射（1 MHz，2 W/cm²，3 min）。如图7a所示，SCACDs相比于柳氮磺胺吡啶具有更好的肿瘤抑制效率。值得注意的是，SCACDs中药效团的注射剂量几乎是柳氮磺胺吡啶的10倍。在超声波照射下，SCACDs产生的活性氧极大地增强了抗肿瘤效果，SCACDs+ 超声组可实现完全的肿瘤消除，且无肿瘤复发。为了更深入地了解SCACDs的抗肿瘤效果，作者进一步进行了苏木精-伊红染色和TUNEL染色。如图7e所示，SCACDs+超声组显示出高水平的黑色素瘤细胞的凋亡。此外，小鼠的生存曲线（图7b）表明了SCACDs是治疗黑色素瘤的高性能纳米药物。如图7c所示，在整个实验期间，各组小鼠的体重差异并不明显，主要脏器的苏木精-伊红染色证实了SCACDs的高生物相容性（图7d）。以上结果共同表明，SCACDs可以在活体层面作为高效的抗肿瘤纳米药物。
图7. SCACDs在小鼠黑色素瘤模型上的抗肿瘤效果。
https://doi.org/10.1039/D4SC05280C
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*本文为课题组供稿。
