碳点人注：
外伤和手术后的伤口往往面临复杂的愈合问题，因此，采用符合人体自然伤口愈合过程的治疗方案对伤口的成功治愈至关重要。伤口修复通常包括四个相互依赖的阶段：止血、炎症、增殖和组织重塑。在这些阶段中，安全、便捷且有效的止血常常被忽视。然而，传统止血剂（如海绵、纱布和粉末）由于粘附性差且对不同类型的伤口效果有限，存在明显不足。此外，复杂的生产工艺以及生物相容性和生物安全性的要求，进一步限制了新型止血材料的推广应用。
新一代伤口敷料不仅具备止血功能，还能够满足更高层次的治疗需求。伤口破裂使局部组织失去皮肤屏障的保护，为病原体入侵及伤口周围的持续感染创造了条件。这些感染会导致氧化应激、pH 值改变以及持续的炎症反应，从而形成不利于愈合的微环境。在这种恶劣的环境中，新生的内皮细胞容易受损，导致局部血管生成受阻，进而影响营养供应和免疫功能，使伤口陷入慢性且难以愈合的状态。因此，设计一种兼具生物相容性与高安全性的材料，满足伤口愈合过程中不同阶段的需求，是实现理想治疗效果的关键。
近日，复旦大学熊焕明课题组与上海交通大学医学院附属第九人民医院毛远青课题组合作，以头发为原料成功制备了血余炭碳点(CrCi-CDs)。课题组随后通过简便的自组装方法开发了一种负载多功能血余炭碳点的油凝胶(CrCi-CDs/OG)伤口敷料。该敷料不仅能够快速止血，还有效抑制细菌滋生，调节伤口周围的氧化应激和炎症微环境，促进新生血管生成，加速伤口愈合。其制备工艺简单、成本低，具有广阔的生物医用材料应用前景。
血余炭碳点油凝胶的制备及作用示意图。
相关成果以“Multifunctional Carbon Dots Derived from Human Hair for Fast Healing Wounds Together with Oleogels”为题发表在《Small Structures》上。第一作者是上海交通大学附属第九人民医院的石晓锋，共同一作是复旦大学的马千里。
1. 血余炭碳点油凝胶的合成与表征
透射电子显微镜（TEM）图像显示，所制备的CrCi-CDs具有均匀的尺寸和良好的分散性，直径范围为2-6纳米，平均粒径为3.8纳米（图1A）。如此小的颗粒尺寸使CrCi-CDs能够轻松穿透皮肤屏障。根据高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）图像及图1B中的插图，CrCi-CDs具有良好的晶体结构，晶格间距为0.21纳米，对应于石墨的(001)晶面。在CrCi-CDs的傅里叶变换红外光谱（FTIR）图中（图1C），2920和2860 cm⁻¹的两个峰分别代表–CH3和–CH2的sp3和sp2 C─H伸缩振动。3500–3200 cm⁻¹范围内的峰则归因于O─H和N─H键的伸缩振动。1340 cm⁻¹处的峰可识别为氨基C─N伸缩振动，1665和1450 cm⁻¹处的峰则分别对应C═O和C═C的振动。因此，CrCi-CDs表面富含羟基、氨基和羰基/羧基等官能团。X射线光电子能谱（XPS）数据（图1D）确认了CrCi-CDs主要由三种元素组成，分别是C（73.04%）、O（14.76%）和N（12.2%）。详细的峰拟合结果（图1E、F）表明，碳和氮以多种形式存在，如C─C、C═C、C═O、C─N和C─O键，这与前述FTIR分析结果一致。
图1. 血余炭碳点的表征。
制备好的OG在室温下呈黄色固体，而CrCi-CDs/OG则为透明棕色固体，这表明CrCi-CDs在OG中均匀分散（见图2A）。图2B通过偏光显微镜比较了OG与CrCi-CDs/OG的晶体形态。图2C展示了OG与CrCi-CDs/OG的FTIR光谱，其中CrCi-CDs的特征峰被OG覆盖，表明CrCi-CDs在复合材料中分布稳定。图2D和2E显示了OG与CrCi-CDs/OG的表观黏度。图2F展示了两种样品的频率扫描曲线，其中G'和G''分别代表整个频率范围内的粘弹性和凝胶强度。总体来看，两者的G'值均高于G''，表明它们具有弹性固体行为且以黏性为主。
图2. 血余炭碳点油凝胶的表征。
2. 血余炭碳点油凝胶的生物相容性
图3A展示了对四个样本进行的溶血试验，其中OG组、CrCi – CDs组以及CrCi - CDs/OG组的溶血率低于4%，与PBS组的上清液情况相同（图3B）。相反，经去离子水（DW）处理后，溶液变红，表明发生了溶血现象。随后，分别对HUVEC和RAW264.7细胞进行了1天、3天和5天的细胞毒性试验。结果表明，经处理的所有细胞均保持较高的活性（图3C、D）。同时，活/死细胞染色结果显示，经处理后HUVEC和RAW264.7细胞的数量逐渐增加，且细胞形态保持良好（图3E、F）。
图3. 血余炭碳点油凝胶的生物相容性。
3. 止血试验
采用兔肝脏出血模型来评估血余炭碳点油凝胶体内的止血能力（图4A）。与对照组相比，单独OG组未显示出明显的止血能力（图4B）。然而，当使用CrCi - CDs或者CrCi - CDs/OG治疗时，出血时间和出血量均显著减少（图4C、D）。此外，CrCi - CDs或者CrCi - CDs/OG的凝血指数（BCI）也均低于空白组，表明CrCi - CDs在体外也具有较好的止血能力（图4E）。
图4. 血余炭碳点油凝胶的止血能力。
4. 抗菌实验
活/死菌染色结果表明，CrCi - CDs和CrCi - CDs/OG对MRSA和大肠杆菌有良好的抑制作用，而单一的OG没有抗菌作用（图5A）。就分别对MRSA和大肠杆菌的抗菌效果而言，CrCi - CDs对大肠杆菌60.73%的抑制率优于对MRSA的52.58%的抑制率（图5B、C）。菌落计数也证实了OG没有抗菌作用（图5D）。在空白组中，MRSA和大肠杆菌的相对菌落形成单位（CFU）均为100%，经CrCi - CDs处理后分别为24.25%和13.11%，经CrCi - CDs/OG处理后分别为16.58%和15.30%（图5E、F）。生物膜的存在对细菌生长也起着重要作用。结晶紫染色结果证实，CrCi - CDs/OG能够抑制细菌生物膜形成（图5G - I）。
图5. 血余炭碳点油凝胶的抗菌能力。
5. 抗炎和抗氧化实验
在此，我们在RAW264.7细胞中建立了脂多糖（LPS）诱导的炎症模型，并通过实时定量聚合酶链反应（RT - qPCR）观察炎症因子的释放情况。结果表明，与对照组相比， OG组、CrCi – CDs组和CrCi - CDs/OG组均能够减少炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的释放（图6A - D）。随后，利用DCFH - DA探针检测细胞内活性氧的释放情况。结果显示，OG组和CrCi - CDs/OG组均显著降低了HUVEC和RAW264.7细胞中的ROS水平。此外，添加CrCi - CDs并没有显著增强抗氧化能力（图6E、F）。
图6. 血余炭碳点油凝胶的抗炎、抗氧化能力。
6. 促血管生成实验
首先，使用EDU标记各实验组中增殖的HUVECs（图7A），结果显示CrCi-CDs和CrCi-CDs/OG显著促进HUVECs的增殖，而单独的OG没有这种效果（图7B）。随后，通过伤口愈合和Transwell迁移实验分别测量HUVECs在水平方向和垂直方向的迁移能力（图7C-F）。结果显示，与空白组相比，CrCi-CDs在水平方向和垂直方向上都能促进HUVECs的迁移。最后，通过血管生成实验评估CrCi-CDs/OG的促血管生成能力。经过8小时的诱导后，Calcein-AM染色的HUVEC形成了毛细血管样网络（图7G）。CrCi-CDs和CrCi-CDs/OG的血管分支点数和网格面积均显著高于对照组和OG组（图7H,I）。
图7. 血余炭碳点油凝胶的促血管生成能力。
为探究CrCi-CDs促血管生成特性的潜在分子机制，进行了全面的RNA测序分析。主成分分析（PCA）显示对照组和CrCi-CDs组之间存在显著的转录变异（图8A）。图8B显示了对照组和CrCi-CDs组之间1460个差异表达基因（DEGs）的表达模式热图。进行KEGG通路富集分析以阐明上述DEGs调节的细胞信号通路，代表性信号通路如图8C所示。对这些DEGs的GO富集分析包括生物学过程、细胞成分和分子功能（图8D）。从生物学过程的分析中可以观察到，CrCi-CDs主要影响HUVECs中的DNA复制、转录和翻译，这与细胞增殖密切相关。
随后，生成了一个弦图以说明主要通路和关键基因之间的关系（图8E）。考虑到PI3K-Akt信号通路与血管生成之间的密切关系，为PI3K-Akt信号通路中发生变化的基因创建了一个热图（图8F）。发现CrCi-CDs对PI3K-Akt信号通路的激活与PIK3R2、FGFR4和FGFR1等转录因子的上调有关。总之，通过RNA测序分析，对CrCi-CDs促进HUVECs增殖、迁移和血管生成的机制有了更深入的了解，发现PI3K-Akt信号通路在这一过程中发挥了重要作用。
图8. CrCi-CDs 处理HUVEC后的 RNA 测序结果。
7. 伤口愈合体内实验
大鼠背部皮肤缺损模型用于体内评估伤口愈合情况。整个愈合过程中，实验组的愈合速度快于对照组，其中CrCi-CDs/OG效果最佳（图9A、B）。在14天后，CrCi-CDs/OG处理的伤口面积仅为初始面积的15.10%，而对照组的面积为47.76%（图9C）。从伤口闭合率来看，愈合速度的顺序为CrCi-CDs/OG > OG > 对照组（图9D）。
图9. CrCi-CD/OG 在 SD 大鼠全层伤口模型中的促进伤口愈合作用。
经过14天的治疗，对伤口及周围皮肤组织进行提取并进行组织学分析，以进一步评估伤口愈合效果。H&E染色显示新生肉芽组织和血管的形成（图10A）。与对照组相比，OG组和CrCi-CDs/OG组的疤痕宽度显著减少（图10B）。Masson三色染色更清晰地展示了胶原沉积和新生血管的存在，这两者与伤口愈合速度密切相关（图10C）对胶原密度的定量分析显示，所有实验组的胶原沉积均高于对照组（图10D）。最后，进行CD31免疫组织化学染色，对血管内皮细胞进行定量分析（图10E）。结果表明，对照组和OG组的CD31表达较低，而CrCi-CDs/OG组的CD31表达较高，进一步证实了CrCi-CDs强大的促血管生成潜力（图10F）。
图10. 组织病理及免疫组化分析。
以碳化的人类头发为原料制备出一种多功能碳点，其尺寸均一、表面基团丰富且分散性极佳。所制得的CrCi - CDs具有快速止血、抑菌、调节伤口微环境、促进血管生成和加速伤口修复的功能。将这些CrCi - CDs加入由蓖麻油和卵磷脂制成的OG后，CrCi – CDs/OG具备体内外快速止血、抑制细菌增殖及生物膜形成、改善伤口微环境、促进新血管形成以及加速伤口愈合的能力。体内外实验均表明，CrCi – CDs/OG在促进伤口愈合方面具有显著潜力。本研究为应对生物医学研究中的挑战引入了一种新方法和方向，这表明源于生物质的碳点凭借其天然的生物安全性和生物相容性，在不久的将来将被开发成为一类新型复合治疗剂。
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https://doi.org/10.1002/sstr.202400435
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*本文为碳点人邀稿，课题组供稿，首发于碳点人公众号，转载请注明出处。
