碳点（CDs）是一种新型的碳基纳米材料，具有丰富的表面官能团和多样的物理化学性质。同时，它们还具有很高的生物相容性，这为开发理想的抗菌“武器”提供了广阔的平台。近年来，具有抗菌和抗生物膜能力的碳点在抗细菌感染方面引发了越来越多的关注，并展现出巨大的应用前景。在这一过程中，控制感染和促进修复同等重要。因此，在发挥抗菌活性的同时，修复受损组织对抗菌碳点的临床应用具有重要意义。然而，传统的抗菌剂一般都存在疗效脱靶的问题，容易对人体细胞产生副作用，延缓治疗进程。
在之前的研究中，本课题组从天然抗菌肽中得到启发，开发出了L-精氨酸衍生碳点（Arg-CDs），并有趣地发现抗菌碳点确实能促进典型细胞的生长，意外地实现了抗菌活性和促进细胞增殖的功能整合，在细菌感染的理想治疗中展现出了广阔的潜力。为了破坏已形成的生物膜（Arg-CDs无法实现这一目标），进一步开发出了抗菌活性更强的两性碳点。遗憾的是，改性后的碳点没有表现出之前所具备的功能整合性。因此，如何确保和发展原有的整合策略，以打破抗菌作用与促进细胞生长之间的固有权衡，仍是一项挑战，其潜在机制更值得探索。
本工作L-精氨酸为前驱体，铜盐为掺杂剂，通过简单的一锅溶剂热法制备了铜掺杂碳点（Cu-CDs），以提高碳点内部的电子传递效率，提供更多的催化活性位点。与Arg-CDs相比，具有协同类酶活性的Cu-CDs可显著提高感染部位的ROS水平，大大提高了碳点的抗菌能力，从而有效清除细菌生物膜。同时，通过体外细胞培养和体内动物实验，验证了Cu-CDs的细胞增殖促进特性，支持感染伤口的组织重塑。此外，我们还探索了其对细菌和哺乳动物细胞具有超强选择性的内在机制。
相关成果以“Unusual Antibacterial Property and Selectivity Enabled by Tuning Nanozyme Activities of L-arginine Derived Carbon Dots”为题发表在Advanced Healthcare Material上。文章通讯作者为南京理工大学邢晓东副教授，贡雪东教授，苏州大学李斌教授。第一作者为南京理工大学博士生于美哲。
1. 理化性质表征
基于之前的研究，本工作L-精氨酸为前驱体，铜盐为掺杂剂，通过简单的一锅溶剂热法制备了铜掺杂碳点（Cu-CDs）。
图1. Cu-CDs的(A)HRTEM图像和粒度分布；(B)水合粒径；(C)傅立叶变换红外光谱；(D) XPS全谱以及C1s、N1s和Cu2p的高分辨率光谱；(E) Zeta电位；(F)紫外可见光谱；(G)荧光光谱及其归一化曲线。
2 类酶活性
铜掺杂改变了碳点内部的电子结构，赋予其优异的类酶活性。酶促反应表现出协同效应，催化O2生成H2O2，并将其转化为氧化能力更强的·OH和·O2-。感染部位ROS水平的增加可有效杀死细菌，甚至破坏已形成的生物膜，这表明Cu-CDs 有可能取代传统抗生素用于抗菌治疗。
图2. Cu-CDs 的类酶特性。(A)类酶催化活性和检测方法示意图；(B)类OXD活性；(C) 类POD活性；(D) Cu-CDs对H2O2或TMB的酶促反应动力学检测；(E) Cu-CDs、Fe3O4 NPs和HRP的迈克尔斯-门顿常数（Km）和最大反应速率（Vmax）；(F)不同处理后MB的吸收光谱；(G)不同处理后NBT的吸收光谱。
3. 抗菌性能
由于Cu-CDs具有出色的类酶活性，因此对其抗菌活性进行了系统评估。与Arg-CDs的温和抗菌能力相比，Cu-CDs 的抗菌效果明显增强。
图3. 抗菌活性。(A)对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌效率；(B)金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在与Cu-CDs共孵育前后的扫描电镜图像；(C) 蛋白质泄露实验。
4 抗生物膜性能
生物膜为被包裹在其中的细菌提供了一个物理屏障，防止外界物质的侵入和不利条件的影响，从而阻碍了抗菌剂的渗透和扩散，减少了抗菌剂与细菌的直接接触，从而降低了抗菌剂的效果。加剧了抗菌剂的无效性和耐药性的产生。经过对抗生物膜特性的系统评估，证明了Cu-CDs 能有效抑制生物膜的形成，清除已形成的成熟生物膜，从而提高抗菌效果，降低抗菌剂耐药性的风险。
图4. 抗生物膜活性。结晶紫染色实验中Cu-CDs对(A)生物膜形成的抑制作用和(B)对成熟生物膜的破坏率；(C)用Cu-CDs处理后成熟的金黄色葡萄球菌生物膜的SEM和CLSM图像。
5 体外细胞毒性
在适当的浓度下，Cu-CDs在促进细胞增殖方面与Arg-CDs具有相同的效果，并且不会引起溶血。此外，与Arg-CDs不同的是，当处理浓度约为 125 μg mL-1 时，Cu-CDs 在抗菌和抗生物膜实验中表现出良好的效果。因此，在50-250 μg mL-1 的低浓度范围内，Cu-CDs可以有效地将抗菌活性和促进细胞增殖结合起来，这使其在生物医学和公共卫生领域的实际应用前景十分广阔。
图5. (A)细胞活性；(B)细胞活/死染色实验；(C)溶血实验。
6 对细菌和细胞的选择性机制
细菌细胞表面比哺乳动物细胞表面带更多负电荷。阳离子氨基酸衍生的Cu-CDs 表面带正电荷，通过静电作用优先与细菌结合，而不是哺乳动物细胞。细菌无法直接吞噬细菌细胞外的纳米粒子，而主要通过能量依赖性方式（如直接穿透细胞膜）摄取纳米粒子。此外，Cu-CDs聚集在膜表面，诱导产生大量高毒性ROS，导致膜脂质过氧化，影响膜的通透性或直接破坏膜结构。这种膜破坏过程加速了Cu-CDs进入细菌内部。具有卓越酶样活性的碳点迅速提高了细菌体内的ROS水平，造成不可逆的氧化损伤，从而导致细菌细胞死亡。由于Cu-CDs与近中性表面之间的静电作用效率较低，哺乳动物细胞吸附了少量纳米粒子，并通过有效的内吞作用将其内化，并将Cu-CDs 封存在内含囊泡中，这将减少其对细胞活动的不利影响。此外，活细胞内的抗氧化系统通过SOD维持较低的ROS水平。一般认为，ROS是细胞应激和细胞凋亡效应分子的主要诱导因子。然而，最近有研究报告称，将哺乳动物细胞暴露于低剂量的ROS可刺激细胞生长和有丝分裂。与不具有酶样活性的Arg-CDs相比，低浓度的Cu-CDs可促进哺乳动物细胞增殖，快速杀死细菌，并有效消除已形成的生物膜，这可归因于其协同的类OXD和POD活性。
图6. (A) Cu-CDs处理后细菌和细胞的胞内ROS水平；(B) Cu-CDs对细菌和细胞中总SOD活性的抑制率；(C)在胞吞抑制剂存在下，Cu-CDs处理后细胞的活/死染色图像；(D) Cu-CDs的选择性示意图。
7 感染伤口愈合的体内评估
这些研究结果表明，低浓度的Cu-CDs能有效杀死细菌并清除体内已形成的生物膜。在组织修复过程中，它们能减轻炎症浸润，促进细胞增殖，加快伤口愈合。因此，可用于临床抗感染治疗，同时在哺乳动物体内控制细菌感染和加速伤口愈合。
图7. Cu-CDs对体内金黄色葡萄球菌感染伤口的治疗效果。(A)金黄色葡萄球菌伤口感染模型的构建和治疗策略示意图；(B)三组小鼠背部伤口在不同时间点的照片；(C)各处理组的伤口收缩率；(D) 伤口组织中存活的金黄色葡萄球菌数量；(E)使用H&E染色对伤口组织进行组织学分析。
本文利用溶剂热法成功构建了具有显著类氧化酶和类过氧化酶样活性的Cu-CDs。因其协同的类酶活性，可迅速提高感染部位的ROS水平，杀死游离细菌并清除已形成的生物膜，因此抗菌活性明显优于Arg-CDs。此外，它还具有防止微生物感染和促进组织修复的双重功能。在50-250 μg/mL-1 的低浓度下，促进细胞增殖的能力得以保留，这为进一步开展临床转化工作提供了支持。Cu-CDs的超选择性机制可能源于哺乳动物细胞的内吞作用将其限制在囊泡中，从而减少了对细胞生命活动的不利影响。与此同时，细胞中的抗氧化防御系统将Cu-CDs诱导的ROS维持在较低水平，而这又可作为有丝分裂信号剂促进细胞增殖。该方案不仅为抗击细菌感染提供了一种高效安全的 “理想武器”，同时为多功能生物材料的集成提供了启示。
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https://doi.org/10.1002/adhm.202403201
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