碳点 （CDs） 是一种新型超小碳纳米材料，具有低毒性、优异的生物兼容性、可调的带隙发射和多功能的光物理特性等显着优势。最近，基于CDs的生物医学应用引起了相当大的兴趣，特别是在荧光（FL）成像和肿瘤治疗方面。使用近红外（NIR）发光碳点具有改善的组织成像能力和增强的穿透深度等优势。然而, CDs的高效近红外发光仍是一个重大挑战。在各种肿瘤治疗策略中，肿瘤光热疗法（PTT）因其副作用小和独特优势而脱颖而出。然而，由于荧光（辐射跃迁）和光热转换（非辐射跃迁）之间的竞争光物理过程，实现高效的近红外发射和高的光热转换效率仍然是一个重大挑战。因此，在CDs中实现FL和光热过程之间的平衡可以扩展它们的生物医学应用。
主要的挑战在于CDs在水溶液中的近红外效率有限，这限制了它们在荧光成像中的效果。克服 CDs 在水溶液中的猝灭效应并改善其近红外发光已成为关键目标。为解决这一挑战，已经提出了各种方法，如表面钝化，能量传递，和表面修饰。然而，同时实现高效的近红外发光和有效的肿瘤光热疗法仍然是一个挑战。同时，提高CDs在肿瘤中的富集效率通常需要增大颗粒尺寸，这可以增强肿瘤靶向性，但也会引发体内富集的担忧。因此，主要挑战在于在不增加颗粒尺寸的情况下，同时提高近红外荧光和光热疗法的效果
本课题组之前成功合成了近红外发光和高光热转换效率的CDs（Light: Science & Applications 2018,7,91）。然而，这些CDs在水溶液中容易荧光淬灭，且其小尺寸限制了有效的肿瘤富集，从而影响了光热治疗的效果。本工作通过引入D-Arg修饰，不仅改善了CDs的近红外发光，还延长了它们在体内的代谢时间，从而增强了肿瘤富集并显着提高了光热治疗效果。
相关成果以“D-Arginine-Functionalized Carbon Dots with Enhanced Near-Infrared Emission and Prolonged Metabolism Time for Tumor Fluorescent-Guided Photothermal Therapy”为题发表在Journal of Colloid and Interface Science上。文章通讯作者为澳门大学曲松楠教授，第一作者为澳门大学博士毕业生王黎明（现为赣南医科大学青年教师）。
CDs 的合成方法按照我们之前研究中概述的方法。将 CDs与不同浓度的 D-精氨酸在 45°C 水溶液中混合 15 分钟，然后冷却至室温，制备 D-Arg 和 CDs 复合物，如图 1a 所示。激发的电子通常通过热形式的辐射或非辐射跃迁释放到基态。为了平衡 CDs 与 D-精氨酸络合后的 FL 和光热过程，在不同质量比下评估 CDs 和 D-精氨酸络合物的光学和光热转换特性，以优化络合比。结果显示，当质量比小于1:10时，络合物中CDs在665 nm处的紫外-可见吸收带先增强并略微蓝移，随后随着D-精氨酸浓度比CDs高出10倍时，吸收带逐渐减弱，如图1b和S1所示。在 550 nm 和 630 nm 激发下，CDs 和 D-精氨酸复合物的 FL 发射带分别在 650 nm 和 700 nm 处达到峰值，且随着D-精氨酸浓度增至碳点浓度的10倍，荧光强度显着增强。随后，随着D-精氨酸浓度的进一步增加，增强速率逐渐减缓（图1c、1d、S2及S3）。CDs 和 D-精氨酸配合物的红光发射的 PL 衰变曲线比纯 CDs 的寿命更长（图 1e），这与增强的发射光谱非常吻合。采用功率密度为1 W/cm²的655 nm激光器，对比研究了碳点（CDs）、碳点与D-精氨酸复合物在水溶液中的光热性能。纯 CDs 表现出卓越的光热性能，在 655 nm 激光照射 10 min 后，其 100 μg/mL 水溶液从室温达到 73.5°C。在以10 倍的质量比与 D-精氨酸络合后，复合物的光热性能略有下降，但在相同的激光照射下保持近 70°C 的温度升高。然而，在较高的 D-精氨酸浓度下，该值降至 45.8°C，表明在高 D-精氨酸络合浓度下光热性能下降。有趣的是，NIR 发光 （Em 700 nm） 在 1：10 的络合质量比下得到了最大增强（图 1f）。考虑到 NIR 发射的显着改善以及令人满意的光热性能，我们选择 1：10 的质量比作为最佳络合条件，并将该比例（1:10）的 CDs 和 D-精氨酸络合物命名为 D-Arg@CDs。通过计算发现，D-Arg@CDs 水溶液的光热转换效率高达 55%。在水溶液中，在 655 nm 激发下，CDs 在 NIR 区域的 PLQY 低至 0.2%。与 D-精氨酸复合后，在 655 nm 激发下，D-Arg@CDs 在 NIR 区域的 PLQY 增强至 1.1%。
图1. (a) D-Arg@CDs的制备过程示意图。(b) UV-Vis吸收光谱。(c) 550 nm激发下的荧光(FL)光谱。(d) 630 nm激发下的荧光光谱。(e) 512 nm激发下在650 nm处记录的光致发光(PL)衰减曲线。(f) PL峰位置和温度变化。(g) 不同合成质量比的CDs和D-Arg@CDs水溶液的温度变化。
透射电子显微镜 （TEM） 用于表征 CDs 和 D-Arg@CDs 的形态，如图 2a 和 b 所示。TEM 图像显示 CDs 和 D-Arg@CDs 均匀分散，直径相似，约为 6 nm，表明在 CDs 上修饰 D-精氨酸不会增加粒径。CDs 和 D-Arg@CDs 的高分辨率 TEM 图像呈现了 0.21 nm 的清晰均匀晶格条纹，对应于石墨的 （100） 晶格平面。傅里叶变换红外光谱 （FT-IR） 用于验证 D-精氨酸和 CDs 之间的表面结合相互作用。如图 2c 所示，3360 cm-1 处的宽带对应于 D-精氨酸中胍基团的 ν（N-H） 拉伸振动。D-精氨酸的胍基团和 CDs 的羧基之间形成氢键，导致胍基团的 N-H 拉伸振动发生变化，导致峰位发生明显偏移。CDs 的红外光谱中在 1699 cm-1的峰对应于 -C=O。通过与 D-精氨酸络合形成氢键时，观察到峰位置的明显变化。如图2d所示, 通过1H NMR光谱进一步观察络合过程，D-精氨酸中的氨基在3.14 ppm处显示化学移位。然而，将CDs与D-精氨酸结合后，氨基信号移至3.34 ppm。这归因于D-精氨酸的-NH2基团与CDs上之间形成氢键，导致化学位移值发生变化。
图2. （a） CDs 和 （b） D-Arg@CDs 的 TEM 图像;（c） D-Arg@CDs、CDs 和 D-Arg 的 FT-IR 光谱;（d） D2O 中 CDs、D-Arg 和 D-Arg@CDs 的 1H NMR。
为了研究D-精氨酸修饰后荧光性质的变化，我们比较分析了D-Arg@CDs和CDs水溶液中的激发（EX）-发射（EM）图谱，如图3a和b所示。CDs 在 550 nm 处表现出明显的绿色发射中心，对应于核心态。相比之下，D-Arg@CDs展现出约700 nm的增强近红外发射中心，这可归因于表面相关态。为了进一步研究CDs和D-Arg@CDs的光动力过程，在400nm激发下进行了瞬态吸收光谱测试。光激发后，在570nm附近出现了与碳核心对应的广泛的基态漂白信号，如图3c-f所示。相反，D-精氨酸的修饰导致在650nm附近出现了显着的表面相关状态漂白信号，表明能量从核心转移到了表面。漂白信号的动力学揭示了能量转移速率为4.1 × 1011 s-1。这些结果表明，D-精氨酸通过阻止与水分子的直接接触，有效减少了水中的能量损耗。因此，D-Arg@CDs在水中表现出改进的近红外发射。
图3. (a) CDs和(b) D-Arg@CDs水溶液中的激发发射图。在水溶液中，(c) CDs和(d) D-Arg@CDs在λpump = 400 nm（1 kHz，50 fs）下激发后的TA光谱。(e) CDs和(f) D-Arg@CDs水溶液的550 nm（红色符号/线）和630 nm（蓝色符号/线）光漂白信号动力学。
在HepG2、Huh7和Hepa1-6细胞中评估CDs和D-Arg@CDs的细胞毒性，显示CDs和D-Arg@CDs对细胞几乎没有毒性。如图4a所示，CDs和D-Arg@CDs在100μg/mL时对细胞活力的影响最小。Zeta电位分析表明CDs表面具有负电性（图4b），用D-精氨酸修饰后，D-Arg@CDs的表面电荷变为正电性，有利于穿过带负电荷的细胞膜。图4c显示了在用543nm激光激发下与D-Arg@CDs孵育1.5小时的Hepa1-6细胞的清晰红光荧光图像。相反，CDs孵育的细胞表现出较弱的荧光信号。高倍率下的观察（图S7）显示D-Arg@CDs主要分布在细胞质中。我们之前的研究中也报告了类似的观察结果。这些结果表明，反向表面电荷积极促进了细胞对D-Arg@CDs的吸收增强，利于用于生物成像和生物医学应用。对Hepa1-6细胞进行活/死细胞成像测定，以证明D-Arg@CDs的光热诱导杀伤能力。细胞用D-Arg@CDs或CDs（100μgmL-1）处理1小时，用655nm激光照射10分钟，然后在37°C下用钙黄绿素乙酰氧基酯染色30分钟。用PBS溶液洗涤3次后，使用FL显微镜检查细胞。研究结果显示，细胞在光照射前表现出绿色FL，表明细胞处于活状态，进一步证实了D-Arg@CDs优异的生物兼容性。激光照射后，细胞呈红色FL，表明肿瘤细胞已死亡（图4d和图S8）。这些结果表明D-Arg@CDs通过光热机制具有强大的肿瘤杀伤能力。此外，D-Arg@CDs表现出有效的肿瘤摄取和局部PTT，能够有效根除肿瘤，同时最大限度地减少对健康组织的毒性。
图4. （a） CDs 和 D-Arg@CDs 在HepG2、Huh7 和 Hepa1-6 细胞中 24 小时的相对活力;（b） CDs 和 D-Arg@CDs 在水溶液中的 Zeta 电位光谱 （c） Hepa1-6 细胞在 405 nm 和 543 nm 激发下与 CDs 和 D-Arg@CDs 孵育 1.5 h 的 FL 共聚焦显微镜图像。（d） 在 655 nm 激光照射前后D-Arg@CDs 和 CDs 处理的 Hepa1-6 细胞的活/死细胞成像测定。
考虑到低细胞毒性，高细胞摄取，以及优异的近红外区发光性能，我们通过体内FL成像评价了CDs、D-Arg@CDs和L-Arg@CDs的生物相容性和体内分布。如图5a所示，在向小鼠静脉注射CDs、D-Arg@CDs和L-Arg@CDs后不同时间间隔（1h、3h、12h、24h和48h）取出心、肝、脾、肺和肾等主要器官，进行体外FL成像。在注射前，主要器官在589nm激光激发下未显示红色荧光。然而，静脉注射D-Arg@CDs1小时后，肝脏和肾脏在589nm激光激发下显示出红色荧光信号。相比之下，对于CDs和L-Arg@CDs，这些信号在注射24小时后逐渐减弱并最终消失。值得注意的是，即使在48小时后，D-Arg@CDs的肾脏仍然显示荧光，表明D-Arg修饰的CDs在小鼠体内具有延长的代谢时间。如图5b所示，将三组小鼠分别通过尾静脉注射CDs溶液、D-Arg@CDs溶液和L-Arg@CDs溶液。随后，小鼠体内最初1小时内表现出强烈的全身红光，6小时后逐渐减弱。D-Arg和L-Arg修饰后，D-Arg@CDs和L-Arg@CDs富集在肿瘤组织中。然而，D-Arg@CDs在肿瘤组织中停留的时间更长，这表明D-精氨酸可以延长CDs在体内的代谢，增加其在肿瘤组织中的积累。
图5. (a) 注射CDs、L-Arg@CDs和D-Arg@CDs后，不同时间的近红外（NIR）FL图像。(b) 各种时间点，静脉注射CDs、L-Arg@CDs和D-Arg@CDs后，小鼠的近红外（NIR）FL图像。
通过静脉注射进一步评估 D-Arg@CDs 在 NIR 区域对体内肿瘤 PTT 的性能，然后用 1 W cm-2 的 655 nm 激光处理。注射 D-Arg@CDs 的肿瘤区域在激光照射 10 分钟下表现出约 70°C 的温度升高，如图 6a 所示。相反，在同一治疗期间，注射 CDs 和 PBS 的肿瘤组织分别达到约 47°C 和 37°C 的温度。D-Arg@CDs 的 PTT 能力超过了 CDs，凸显了 D-Arg@CDs 更有效的肿瘤治疗的潜力。如图 6b 和 S4 所示，通过监测肿瘤生长进一步评价 D-Arg@CDs 的 PTT 疗效。在对照组中，肿瘤组织随时间持续生长，单独使用 D-Arg@CDs 和激光照射均不能有效抑制肿瘤进展。然而，CD PTT 组对肿瘤生长的抑制最小，主要是由于相对较低的光热温度。相反，用 D-Arg@CDs 治疗的小鼠组表现出对肿瘤生长的显着和显着抑制，导致完全消融，即使在 60 天后也没有观察到复发（图 6b）。这些结果展现了 D-Arg@CDs 卓越的体内 PTT 性能。为了进一步评估抗肿瘤效果，在治疗后第 14 天对小鼠的肿瘤组织进行组织病理学和免疫组织化学分析。对照组对肿瘤组织没有表现出明显的损伤，如图 6d 所示。相比之下，在 D-Arg@CDs 激光组中，H&E 、 c-Cas-3 和 Ki67 染色图像表明显着的细胞损伤和凋亡，伴随着增殖活性的降低。这些结果证实了 PTT 对肿瘤的治疗效果。在 D-Arg@CDs 治疗组的测试中没有可见器官损伤或炎症病变的明显迹象，表明 D-Arg@CDs 对所有这些主要器官的全身毒性较低（图 S5 和图 S6）。
图6. （a）小鼠的红外热图像。（b）接受不同治疗后的小鼠照片。（c）小鼠的肿瘤生长曲线。（d）治疗后14天小鼠肿瘤组织的H&E、c-Cas-3和Ki67染色。
总之，通过用D-精氨酸修饰CDs，合成的 D-Arg@CDs 在水溶液中表现出增强的 FL 效率，同时保持其 55% 的光热转换效果。此外，通过增加它们在肿瘤部位的积累，这些 CDs 在肿瘤治疗中的疗效显着增强，从而同时优化多种功能。D-Arg@CDs 有望作为肿瘤 PTT 的高效光热剂。此外，这种 D-精氨酸修饰策略可能适用于其他 CDs 体系，以促进其光热特性用于临床试验。
本工作受到以下基金资助：
澳门特别行政区科技发展基金(0139/2022/A3, 0007/2021/AKP, 006/2022/ALC)；
深港澳科技计划项目(C类项目)(SGDX20210823103803021)；
澳门大学-华发集团联合实验室资助(HF-001-2021)文献链接：(长按二维码直达）
https://doi.org/10.1016/j.jcis.2024.09.135
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