生产兼具生物安全性和有效性的全癌细胞疫苗（WCCV）对于肿瘤免疫疗法至关重要。焦亡癌细胞由于其高度免疫原性特性，为WCCV的发展提供了一条有前途的道路。然而，基于焦亡癌细胞的WCCV的成功开发还有待完成。自2015年以来，邵峰院士等人的工作在阐明炎症性caspases裂解 gasdermin D（GSDMD）作为焦亡细胞死亡的决定因素方面发挥了关键作用，从而揭开了焦亡神秘的面纱。焦亡的生物学特征是膜中的孔形成、细胞肿胀和裂解，以及促炎细胞因子的释放。大量炎症因子（如IL-1β和IL-18）在膜孔形成后释放出来，从而改变肿瘤微环境，引发强烈的抗肿瘤免疫反应。不可否认，触发体内癌细胞焦亡在肿瘤免疫治疗中具有巨大的潜力。然而，肿瘤免疫疗法更为理想的方法是开发个性化癌症疫苗。患者自身的灭活癌细胞被认为是潜在的个性化癌症疫苗，但总是缺乏有效的免疫刺激，导致抗癌反应有限。我们不禁要思考，含有所有肿瘤抗原且具有免疫原性细胞死亡（ICD）的焦亡癌细胞是否有望成为理想的WCCV。
实现上述设想的第一步便是选取合适的焦亡触发剂（PTA）。因为PTA的选择不仅对于高效可控的诱导癌细胞焦亡至关重要，而且对于促进抗原呈递细胞（APC）随后的抗原呈递级联作用方面也可为举足轻重。因此，PTA 的生物安全性和有效性可能是基于焦亡癌细胞的 WCCV 成功的关键决定因素。目前的研究表明，化疗药物、天然化合物和外场响应性纳米材料都可以作为PTA引发细胞焦亡。遗憾地是，上述已报道的PTA大多数包括化疗/放疗药物、重金属元素或毒性纳米复合物，这些所含的毒性元素会损伤APC，进而影响诱导的免疫治疗效果。在外场诱导细胞焦亡的方法中，通过光响应材料产生的活性氧 (ROS) 已被证明是一种有效诱导细胞焦亡且毒副作用较小的方法。
碳点（CDs）是超小尺寸（<10 纳米）的碳纳米粒子，具有优异的生物相容性、低细胞毒性、可调的带隙和多功能的光物理特性，使其在生物成像和生物医学应用方面具有独特的优势。据报道，在几种 CDs 和 CDs 复合系统中光诱导的 ROS 生成可用于光动力疗法 (PDT) 或光催化疗法 (PCT)。然而，目前尚未见基于纯CDs的光生ROS诱发细胞焦亡的报道。我们之前的工作（Adv. Mater. 2023, 35, 2302705）通过缺陷工程设计了一种无金属CDs在白光照射下实现有效的PCT。因此，我们探究了此类非金属CDs对于构建PCT诱导的焦亡癌细胞疫苗的可能性。
在本研究中，我们报告了光催化CDs在白光LED（WLED）灯照射后通过ROS-线粒体-caspase3-GSDME通路和质子动力驱动的线粒体ATP合成通路有效引起细胞焦亡（图1a）。这些光催化CDs诱导的焦亡癌细胞（PCIP）能有效地超活化巨噬细胞（M0至M1），并上调主要组织相容性复合体（MHC）II类分子表达。APC对肿瘤抗原的有效递送可归因于焦亡细胞本身的促炎特性和CDs复合的焦亡细胞增强的免疫原性的双重作用。在体内，PCIP在有效抗原递送至淋巴结后产生免疫记忆。当遇到同类型的癌细胞时，快速特异性的抗癌免疫被激活，在黑色素瘤和乳腺癌模型中实现高效的肿瘤预防效果。
相关成果以“Photocatalytic Carbon Dots-Triggered Pyroptosis for Whole Cancer Cell Vaccines”为题发表在 Advanced materials 上。通讯作者为澳门大学曲松楠教授，第一作者为澳门大学博士生程全胜，张特森和王青城。此外，致谢每一位文中作者以及在实验中提供帮助支持的老师和同学们。
首先根据我们之前的工作，通过用 2-碘氧基苯甲酸对红色发射 CDs 进行后氧化引入氧相关缺陷来合成光催化 CDs。所获得的 CDs 具有 3.9±1.2 nm 的超小尺寸（图 1b），具有从紫外到近红外波长区域的宽吸收带，在红光激发下具有清晰的近红外发射。在WLED照射下，CDs上的光生空穴表现出强的氧化能力，将OH−氧化为·OH，同时其水溶液被酸化，这通过电子顺磁共振（EPR）光谱中强度比≈1:2:2:1的明显的4线信号（图1d）和明显降低的pH值（图1e）可以看出。随后的细胞活力实验也表明了光催化 CDs 具有强大的光诱导细胞杀伤能力。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像来探究光催化CDs在光控情况下对肿瘤细胞形态的影响，发现经过 WLED 照射后，CDs 孵育的 B16 细胞的 CLSM 图像表现出细胞焦亡的典型特征（气泡肿胀）（图 1g 和 S4，支持信息）。这些数据表明，光催化 CDs 可能是引发癌细胞焦亡有效的PTA。
图1. CDs的光催化杀伤细胞性能。
为了进一步揭示光催化CDs引发的细胞焦亡，首先通过不同的处理在B16（小鼠黑色素瘤）细胞和EMT6（小鼠乳腺癌）细胞中进行相差成像分析。与其他对照组相比，在 WLED 照射后用 CDs 处理的 B16 细胞（组 IV）几乎所有细胞都因质膜上的大气泡而肿胀（图 2a 和 S5，支持信息），表明了高效的细胞焦亡行为。通过流式细胞术分析膜联蛋白 V 和碘化丙啶染色试验进一步证实了细胞死亡的性质。EMT6 和 ID8 细胞也观察到了类似的现象（图 2b 和 S6-S8，支持信息）。GSDM 家族蛋白是识别细胞焦亡发生的特征性生物标志物。已证明 c-caspase3 切割的 Gasdermin E (N-GSDME) 的 N 结构域表达能够引发细胞焦亡。在 IV 组中，c-caspase-3 过表达和 N-GSDME的被切割条带（图 2c），而其他组没有明显的 N-GSDME 表达，这表明光催化 CDs 通过经典的 c-cas3-GSDME 途径引发细胞焦亡。为了揭示 CDs 引发的细胞焦亡的免疫原性形式，我们评估了五种相关代表性 ICD 指标的表达，例如 LDH、ATP、IL-1β、CRT 和 HMGB1。上述代表性ICD指标清晰地反映了CDs引发的癌细胞焦亡的特征，是一种高度免疫原性的细胞死亡形式。
图2. 光催化 CDs 触发的焦亡。
为了进一步探究光催化CDs引发细胞焦亡的机制，通过转录组分析，揭示了CDs引发的B16细胞焦亡（CDs+WLED组）的mRNA变化。热图显示 CDs+WLED 组与 PBS 处理的 B16 细胞（PBS 组）相比，转录组存在明显差异（图 S12，支持信息）。在 CDs+WLED 组中共鉴定出 7920 个差异表达基因，包括 3539 个上调的 mRNA 和 4381 个下调的 mRNA（图 3a）。进行了基因本体论 (GO) 分析，包括分子功能、生物过程和细胞成分，以及京都基因和基因组百科全书 (KEGG) 通路分析，以确定改变的 mRNA 的生物学功能和相应的作用通路。以上分析结果表明，WLED照射后，CDs孵育的B16细胞的差异基因富集在线粒体相关的生物过程和分子功能上，如线粒体、线粒体内膜、线粒体ATP合成等，暗示光催化CDs引发的细胞焦亡与线粒体功能损伤密切相关（图3b，c）。如图 3d 和 S15（支持信息）所示，基于 CDs+WLED 组与 PBS 组的基因集富集分析 (GSEA) 显示，线粒体呼吸链复合物 I、质子动力驱动的线粒体 ATP 合成以及氧化应激和氧化还原途径中的 GO 基因集显着上调。考虑到 WLED 照射后 pH 值降低（图 1a），可以推断光催化 CDs 诱导的 [H+] 上调激活了质子动力驱动的线粒体 ATP 合成途径并促进了细胞焦亡。
图3. 光催化CDs引发的细胞焦亡的RNA测序和数据库分析。
如今，3D 多细胞球体 (3D-MCS) 在癌症干细胞 (CSC) 研究中受到越来越多的关注，因为它们的复杂程度介于 2D 细胞培养和体内肿瘤模型之间。因此，我们首先评估了光催化 CDs 引发的细胞焦亡对 B16（小鼠黑色素瘤细胞）3D-MCS 的影响，作为实体肿瘤微环境的模型。CLSM 成像显示，经 CDs 处理的 3D-MCS 经 WLED 照射（800 lm，20 分钟）后，出现明显的细胞焦亡气泡肿胀。活/死细胞染色试验支持了设计预期，即 3D-MCS 中的 B16 细胞因细胞焦亡激活而被杀死（图 4c）。在研究潜在的抗 MCSC 机制时，我们注意到，在 WLED 照射后，与 CDs 一起孵育的 3D-MCS 中 CSC 标志物的表达降低，包括五跨膜糖蛋白 CD133 和 CD44（图 4b）。这些结果表明了光催化 CDs 引发的细胞焦亡是抑制 3D-MCS 中 CSC 干性和消融的有效策略（图 4a）。以上结果也为我们研究光催化CDs引发的细胞焦亡的体内抗肿瘤性能提供了一个优秀的基础。
图4. 光催化 CDs 引发的细胞焦亡对 3D 肿瘤球体和黑色素瘤小鼠模型的抗肿瘤性能。
激活APC来呈递肿瘤抗原在随后的抗肿瘤免疫识别、免疫反应和免疫记忆中起着至关重要的作用。受细胞焦亡的高度免疫原性死亡特性及其吸引人的肿瘤免疫预防作用的启发，我们尝试利用光催化CDs诱导的细胞焦亡（PCIP）在体外激活巨噬细胞（图5a）。最近有研究强调，细胞形态是细胞功能的强大综合生物标志物（Nature biomedical engineering, 2018, 2，578-588）。作为一种专职的 APC，巨噬细胞 (Mø) 在静息状态下通常为圆形或椭圆形，当受到细菌内毒素（如脂多糖、LPS）刺激时，它们会伸出更长的伪足，尺寸增加，形态不规则（超活化状态，图 S24，支持信息）。超活化状态下的 Mø 具有活跃的分泌能力，能够合成和分泌数百种生物活性物质，并参与和调节免疫反应。如图 5b 所示，用 PBS、H-B16（热灭活 B16 细胞）（图 S25，支持信息）或 CDs 处理的 RAW 细胞的形态没有表现出任何改变，表明它们不足以激活 Mø。相反，与 PCIP(B16) 共孵育的 RAW 细胞表现出过度活跃的形态，类似于高浓度 LPS 诱导的 RAW 现象（图 S24 和 S26，支持信息）。单纯从形态对细胞类型性质的判断是不够充分的，接下来我们用细胞免疫荧光实验和流式细胞术实验进一步检测了相关的MHC II和CD80的表达。PCIP(B16) 诱导的 Mø 的超活化和上调抗原呈递能力反映了 PCIP具有启动抗肿瘤免疫反应的潜能。焦亡的肿瘤细胞具有促炎的特性对招募巨噬细胞具有独特的优势，加之，光催化碳点的多苯环的固有结构和焦亡细胞组成的复合物对其免疫原性的提升可能也促进了巨噬细胞对PCIP的吞噬以及后续的抗原呈递。
图5. PCIP 诱导 Mø 超活化。
基于我们构建的 PCIP 在体外启动免疫反应方面的优异表现，我们接下来研究了将定制 PCIP 作为 WCCV 用于预防肿瘤的可行性。在体内，PCIP在有效抗原递送至淋巴结后产生免疫记忆。当遇到同类型的癌细胞时，快速特异性的抗癌免疫被激活，在黑色素瘤和乳腺癌模型中实现高效的肿瘤预防效果。
图6. PCIP对黑色素瘤及乳腺癌预防效果分析。
综上所述，我们开发了一种基于无毒光催化CDs的高效诱导癌细胞焦亡的方法。此外，我们证实了PCIP作为WCCV用于特定肿瘤预防的可行性。这可能为无毒的PCT材料构建以焦亡细胞为基础的WCCV提供一个参考。目前的研究大多集中于新型PTA的开发和对焦亡新机制的研究，为材料与焦亡介导的纳米医学打下了坚实的基础。当然，这其中也包含着一些挑战和机遇。表观遗传调控引发放射诱导焦亡、超声酶动力诱导细胞焦亡、化疗药物基因调控诱导焦亡、光子介导的ROS诱导焦亡都为我们提供了宝贵的经验，所以我们期待诱导焦亡外场响应性的材料的能量来源方式能得到进一步开发。在光子介导的PTA方面，受限于组织穿透的深度影响，开发远波段（NIR I, NIR II）的PTA用于高效诱导细胞焦亡是我们实验室正在进行的工作。
图七：提出的PCIP诱导特异性肿瘤预防的机制示意图。
本工作受到以下基金资助：
澳门特别行政区科技发展基金(0139/2022/A3，0128/2020/A3, 0131/2020/A3, 0007/2021/AKP, 006/2022/ALC)；
深港澳科技计划项目(C类项目)(SGDX20210823103803021)；
澳门大学-华发集团联合实验室资助(HF-001-2021)；
澳门大学基金(MYRG2020-00164-IAPME)。
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https://doi.org/10.1002/adma.202408685
