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摘要：
甲胎蛋白（AFP）是一种血清糖蛋白，在胚胎发育和肝癌的发病过程中表达。它作为一种临床肿瘤标志物，具有致癌、免疫抑制和运输功能；但其详细的结构信息尚未被报道。在本研究中，我们使用单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析了重组AFP的结构，获得了3.31 Å的冷冻电镜结构，并构建了AFP的原子模型。我们观察并鉴定了AFP的某些结构特征，包括在Asn251处的N-糖基化、结合在不同结构域的四种天然脂肪酸，以及由His22、His264、His268和Asp280残基协调的金属离子。此外，我们比较了AFP和人血清白蛋白之间的结构相似性和差异性。AFP结构特征的阐明不仅有助于更深入地理解其功能机制，还为开发基于AFP的药物载体提供了结构基础。
引言：
甲胎蛋白（AFP）是一种主要在胎儿肝脏和卵黄囊中合成的69 kDa的胎儿血清糖蛋白，其半衰期为4-5天。除了妊娠期间AFP水平较高外，它在肝癌患者的血浆中也能被检测到且浓度升高，因此AFP被认为是最早被识别的肿瘤标志物之一。越来越多的证据表明，AFP在肝细胞癌（HCC）的发展中扮演着重要的生物学角色。具体来说，AFP能够促进HCC细胞的增殖、侵袭和转移，抑制细胞凋亡，并增强干细胞基因的表达。这些恶性行为是通过激活或抑制如cAMP-PKA、RA-RAR、Caspase3、PTEN以及PI3K/AKT/mTOR等信号通路中的下游靶基因表达来实现的。此外，AFP还具有免疫抑制功能。例如，它抑制树突状细胞（DC）的线粒体代谢，诱导DC凋亡；增强自然杀伤细胞（NK细胞）的细胞毒性；改变CD4+/CD8+ T细胞的比例，从而抑制T细胞介导的细胞毒性；还影响巨噬细胞的分化和吞噬活性。通过参与免疫调节，AFP促进了HCC细胞的免疫逃逸，这使得它在HCC的免疫治疗中具有应用潜力，如基于AFP的癌症疫苗和将AFP作为嵌合抗原受体T细胞或T细胞受体T细胞疗法的靶标。AFP在HCC发展中的关键作用及其结构特征尚未详细报告。
自1956年AFP被发现以来，人们对其结构和生化特性进行了广泛的研究，包括蛋白质稳定性、二级结构、配体结合以及二维成像。值得注意的是，最初使用神经氨酸酶和伴刀豆球蛋白A鉴定并分离了AFP的糖蛋白变体。随后的研究利用了各种凝集素来确定AFP中存在的糖链类型，并发现了AFP在妊娠和肿瘤发生过程中独特的糖基组成。AFP-L3是AFP的一种糖型，能特异性结合扁豆凝集素，已成为HCC的一种新型肿瘤标志物。1990年，利用1H-NMR技术成功鉴定了AFP糖肽结构。随后，质谱学及相关技术的进步促进了AFP糖肽类型的有效鉴定，推动了AFP作为肿瘤标志物的发展。然而，糖基化对AFP功能的影响仍不清楚。研究表明，糖基化增强了重组AFP的产生，但其对肿瘤细胞生长和凋亡的影响却很小。此外，AFP还具有与生物分子结合和运输的能力，这些生物分子对胚胎发育过程中的营养运输至关重要。值得注意的是，已经从脐带血衍生的AFP中分离出了各种脂肪酸（FA）。除了能够结合FA外，AFP还能与胆红素形成复合物。尽管AFP对胆红素和FA的亲和力略低于人血清白蛋白（HSA），但它们在空间上的结合位置却惊人地相似。此外，AFP对Zn2+的亲和力高于HSA。蛋白质的结构是其功能的基础，但目前关于AFP结构特征的详细报告尚缺，因此分析其蛋白质结构对于全面了解其功能至关重要。
HSA（人血清白蛋白）是血浆中最丰富的蛋白质，半衰期为19天。HSA和AFP都属于白蛋白家族，但HSA主要在成人肝脏中合成，而AFP在卵黄囊和胎儿肝脏中的合成比例更高。HSA的功能包括维持血管中的胶体渗透压、调节血液pH值、在炎症条件下作为自由基清除剂，以及参与凝血和伤口愈合等过程。HSA还在运输包括蛋白质、脂肪酸、激素、药物和营养物质在内的各种生物活性分子方面发挥关键作用。这些功能依赖于HSA的结构特性，其内部结合位点和表面活性基团能够与许多生物分子相互作用，并在全身范围内运输它们。由于其高血清浓度、长半衰期、频繁再循环、无毒性和无免疫原性等优势特性，HSA被广泛用作各种治疗分子的递送载体。在体内，AFP展现出与HSA相似的运输功能，包括通过胎盘屏障将母体营养物质（如二十二碳六烯酸）运送到胎儿体内，这表明AFP具有作为药物递送载体的潜力。由于某些癌细胞中存在特定的AFP受体，AFP在癌症治疗的靶向药物递送方面比HSA显示出更有前景的潜力。尽管已有众多关于AFP与药物结合用于肿瘤治疗的研究，但AFP与药物的结合机制和作用模式却鲜有探讨。基于HSA的药物递送系统的开发为AFP的检测提供了指导。然而，成功开发AFP和AFP结合药物依赖于对蛋白质结构的全面理解。因此，迫切需要阐明AFP的结构。
在本研究中，我们利用HEK 293F细胞系生产了重组AFP，并成功使用单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）阐明了其结构。本研究对其结构特性进行了详细分析，包括N-糖基化、脂肪酸和金属离子结合位点，并与HSA进行了系统比较。
结果：
AFP整体结构特征
AFP具有类似心脏的不对称形状，尺寸为93.2 Å × 83.3 Å × 59.6 Å，体积为36,030 ų。全长AFP在三维结构中显示出信号肽（残基1-18）和成熟蛋白质（残基19-609）³⁵。AFP主要由α-螺旋组成，约占其二级结构的69%，这些α-螺旋通过环区连接（图2e和补充图2）。AFP具有三个结构域：I、II和III，这三个结构域进一步细分为两个子结构域：IA、IB、IIA、IIB、IIIA和IIIB。这些子结构域由4-6个螺旋组成，并产生潜在的配体结合位点（图2e）。我们确定了AFP在N251位置的N-糖基化以及金属离子的结合。此外，我们还注意到AFP内存在四个不同的天然脂肪酸结合位点，分别位于IIA、IIA/IIB、IIIA和IIIB子结构域中（图2e）。这些发现有助于我们了解AFP的结构特性。
AFP的糖基化特性和潜在的金属离子结合位点
在对AFP结构进行全面研究后，我们在AFP的Asn251处检测到了一个额外的电子密度图。N-连接的糖基化是一种共翻译或翻译后修饰，其中糖链与具有共有氨基酸序列N-X-S/T的特定天冬酰胺残基相连，其中X代表除脯氨酸外的任何氨基酸。AFP中N251周围的氨基酸序列为TKVNFTEIQ，这符合N-连接糖基化的标准（图3a）。因此，我们初步断定这个密度是糖链的结构。通过引入突变，将天冬酰胺替换为丝氨酸（N251S），我们观察到突变体AFP在SDS-PAGE上的电泳迁移率更高（图3b），这表明由于糖基化的缺失，突变降低了AFP的分子量。这进一步证实了电子密度图是糖基化修饰。随后的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析证实，AFP在N251残基处存在N-连接的糖基化，且糖组成多样。N-连接的糖链通常具有由两个N-乙酰葡萄糖胺和三个甘露糖残基组成的核心五糖结构³⁶。我们发现，观察到的电子密度可以容纳三个单糖，它们对应于两个2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖吡喃糖单元和一个β-D-甘露糖吡喃糖单元，而其余两个β-D-甘露糖吡喃糖单元由于其固有的灵活性而表现出不太明显的电子密度（图3c）。综上所述，我们的研究结果强调了AFP中存在N-连接的糖基化，并部分揭示了糖链的结构。N-聚糖的不同组成可能会潜在地影响AFP的生物功能。
此外，我们在四个氨基酸H22、H264、H268和D280的侧链之间观察到了一个明显的电子密度区域。基于已知AFP能够结合某些金属离子³⁷,³⁸，以及在铜锌超氧化物歧化酶（Cu, Zn-SOD）结构（PDB:5k02）中发现的促进锌离子结合的类似基序，我们初步推断这个电子密度对应一个金属离子。我们将AFP的四个氨基酸突变为丙氨酸，获得了突变体AFP-4mut（H22A、H264A、H268A和D280A）。随后，我们使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）评估了野生型AFP和突变体AFP-4mut蛋白与金属离子的结合情况。结果表明，突变体AFP-4mut中金属与蛋白质的摩尔比有所降低，特别是镁、铝、镍和锌等元素（补充图4a）。这意味着AFP中已识别的这四个氨基酸具有结合不同类型金属离子的能力。此外，某些金属元素与AFP的摩尔比超过1，这表明AFP可能在多个位置结合金属离子。His22、His264、His268 和 Asp280 残基参与 Zn²⁺ 的协调，显示了 AFP 对金属离子的高亲和力。Zn²⁺与H22的配位进一步稳定了AFP的N端环结构。比较HSA-Zn²⁺（PDB:5IJF）和AFP的结构，我们注意到锌离子结合所涉及的氨基酸的空间排列和数量存在差异（图4b）。在参与Zn²⁺结合的氨基酸中，HSA缺乏组氨酸，其作用被水分子所取代。
AFP结合脂肪酸的特性
AFP中脂肪酸的结合特性如下（图5b）：在脂肪酸结合位点-1处，脂肪酸与AFP的IIA子结构相互作用。五个螺旋氨基酸残基主要参与与脂肪酸的相互作用，且脂肪酸链主要由疏水氨基酸包围。脂肪酸羧基的方向由带正电荷的极性氨基酸Lys242和Lys246决定，而His266和Met285则有助于形成S形脂肪酸构象。脂肪酸结合位点-2位于AFP子结构IIA和IIB之间的界面上，位于由四个α螺旋形成的浅槽内。三个氨基酸残基Arg233、Asn348和Gln378作为锚定点，将脂肪酸固定在该结合位点上。脂肪酸羧酸头部的方向基于HSA-FA结合模式确定。在脂肪酸结合位点-3处，脂肪酸呈现U形弯曲，完全占据AFP子结构IIIA内的结合口袋。在脂肪酸下方，Glu474与Arg372、Ser408和Arg500之间形成氢键，与其他氨基酸一起形成一个半封闭口袋，这可能是脂肪酸链无法向下延伸的原因。脂肪酸的羧酸基团可能与Tyr435、Lys438和Ser513残基相互作用。脂肪酸结合位点-4是由跨越IIIB子域宽度的疏水通道形成的。脂肪酸在结合口袋内线性延伸。包括Tyr425、Tyr426、Asn429和Lys549在内的几个极性氨基酸决定了脂肪酸羧基的位置。
对AFP的疏水性分析表明，该蛋白的整体外表面是亲水性的，这有利于其在血液中的存在。相反，脂肪酸结合口袋由疏水表面形成，使其适合与疏水分子（如脂肪酸）相互作用。此外，AFP的表面带有更高比例的负电荷，这有助于其较低的等电点。值得注意的是，脂肪酸结合口袋入口处的大多数带正电荷的氨基酸侧链，特别是精氨酸和赖氨酸，可能有助于锚定脂肪酸带负电荷的羧基。此外，我们使用NanoTemper Tycho NT.6测试了蛋白质的热稳定性，发现脱脂后的AFP热稳定性降低。然而，当重新引入脂肪酸时，其热稳定性恢复（图5c），这表明脂肪酸结合促进了AFP的热稳定性。
AFP和HSA的结构对比
人血清白蛋白（HSA）和甲胎蛋白（AFP）的氨基酸序列具有高度同源性，且它们的整体结构非常相似。在比较AFP和棕榈酸人血清白蛋白（PDB:1E7H）的整体结构时，发现第二域几乎完全重叠。在249对精简原子对（总计571对）之间，HSA和AFP蛋白的均方根偏差（RMSD）为1.186 Å（在所有571对原子对中为5.763 Å）。与AFP相比，HSA的第一域更靠近蛋白质的中心，且第三域的A/B亚域也更靠近彼此（图6a）。与HSA类似，AFP也展现出大量二硫键，这些二硫键为AFP提供了结构稳定性。AFP含有32个半胱氨酸残基，所有这些残基都参与了16个二硫键的形成。相比之下，AFP比HSA少了3个半胱氨酸残基和1个二硫键。有趣的是，除了第一个二硫键外，其余二硫键的位置与AFP和HSA中的位置相对应（图6a）。
我们分别比较了AFP和HSA的子域，发现除了AFP的N端区域外，每个子域的构象几乎相同。整体构象差异可能是由配体或底物的结合引起的。比较AFP和HSA的脂肪酸（FA）结合位点，我们发现HSA结合的FA数量多于AFP，且两种蛋白质之间有一些重叠的结合位点（图6b）。将AFP的四个FA结合位点与HSA中相应的位置进行比较，我们观察到以下现象（图6c）：首先，AFP的FA结合位点2和4在结构上分别与HSA的FA结合位点6和5相似。参与FA结合的氨基酸残基的性质也相似。AFP的FA结合位点1对应于HSA的FA结合位点7。两个FA结合口袋均表现出相似的构象。然而，在HSA的IIA和IA子域之间的界面上存在额外的FA结合，FA的羧基部分通过Tyr150、Arg257和Ser287侧链的氢键锚定在HSA的IIA子域中。在AFP中，Arg257和Ser287被非极性氨基酸Gly281和Gly311取代，这使得FA更容易与AFP的IIA结合，而无需穿过IIA和IA。AFP的FA结合位点3对应于HSA的FA结合位点3和4。
与两种蛋白质的结合口袋相关的肽链骨架构象相似；然而，口袋的大小不同。在亚域IIIA中，人血清白蛋白（HSA）与甲胎蛋白（AFP）相比，结合了一个额外的脂肪酸（FA）。参与与脂肪酸羧基相互作用的氨基酸残基不同。在人血清白蛋白中，脂肪酸3（FA3）与丝氨酸342（Ser342）、精氨酸348（Arg348）和精氨酸485（Arg485）形成氢键，而脂肪酸4（FA4）与精氨酸410（Arg410）、酪氨酸411（Tyr411）和丝氨酸489（Ser489）形成氢键。在甲胎蛋白中，脂肪酸的羧基与酪氨酸435（Tyr435）和丝氨酸513（Ser513）相近；谷氨酸474（Glu474）与精氨酸372（Arg372）、丝氨酸408（Ser408）和精氨酸509（Arg509）形成氢键，从而使谷氨酸474（Glu474）的侧链得到稳定和限制。在人血清白蛋白中，脯氨酸384（Pro384）对应于甲胎蛋白中的丝氨酸408（Ser408），导致无法与谷氨酸450（对应于甲胎蛋白中的谷氨酸474）建立氢键。在脂肪酸存在的情况下，人血清白蛋白的谷氨酸450（Glu450）侧链发生了向外构象波动。甲胎蛋白与人血清白蛋白之间的这种结构差异导致了甲胎蛋白结合口袋尺寸相对较小。因此，脂肪酸占据了甲胎蛋白结合口袋的大部分，从而阻碍了其结合过量脂肪酸的能力。
与HSA不同，AFP的IB亚域并未与脂肪酸（FA）结合。HSA和AFP中参与脂肪酸结合的氨基酸特性存在显著差异，如HSA中的精氨酸117（Arg117）对应AFP中的缬氨酸141（Val141），HSA中的天冬氨酸183（Asp183）对应AFP中的丙氨酸206/207（Ala206/207）。我们比较了这两种蛋白质在该亚域中的差异，并发现环的氨基酸组成发生了变化。与HSA相比，AFP在环中有两个额外的氨基酸。HSA环中的两个带正电荷的精氨酸残基（Arg114/Arg117）可能发挥重要作用。在AFP中，这些残基对应于非极性氨基酸（Leu138/Val141）（图6c），这影响了结合口袋的表面电荷和疏水性。因此，环的差异可能是决定这两种蛋白质在此口袋中底物结合的关键因素。
我们对AFP和HSA的所有亚域进行了比较分析，发现两种蛋白质几乎所有亚域的构象都相似。在IA亚域中观察到主要的构象差异，这主要集中在N端区域。AFP中的24个N端氨基酸（AA 19-42）形成一个环，其中来自另一个环的半胱氨酸37（Cys37）和半胱氨酸86（Cys86）形成一个二硫键（图6c），从而稳定了两个环的构象。此外，AFP的组氨酸22（His22）与来自IIA域的三个氨基酸一起，与金属离子形成四面体配位，进一步增强了环结构的稳定性。相比之下，HSA的N端氨基酸形成一个α-螺旋，该螺旋与其他螺旋一起形成了一个小的疏水口袋。HSA的FA2链尾部与这个口袋结合，其羧基锚定在IIA域（图6c）。因此，FA与HSA域I的结合使得域I能够相对于域II旋转，从而促进了连续疏水口袋的形成。这是HSA展现出更紧凑整体构象的原因之一。
讨论
AFP 与人血清白蛋白（HSA）在氨基酸序列和整体结构上高度同源，但它们在细节上存在差异。AFP 较大的脂肪酸结合口袋和特定的金属离子结合位点，使其在某些功能上与 HSA 不同。例如，AFP 对 Zn²⁺ 的亲和力高于 HSA，这可能与 AFP 的额外组氨酸残基有关。
本研究首次报告了AFP的自然结构特征，包括N-糖基化、金属离子结合和脂肪酸结合，以及与HSA的结构相似性和差异性。AFP在肝细胞癌（HCC）的发生和发展中发挥作用，阐明AFP的结构有助于深入了解其生物功能，如AFP及其配体（脂肪酸和金属离子）的协同致癌作用。AFP在不同环境中的差异性糖基化修饰导致了AFP-L3作为一种新型肿瘤标志物的出现。此外，AFP的糖基化修饰可能在识别某些细胞的特异性受体中发挥作用。AFP和HSA之间的结构差异部分地导致了它们表达的组织特异性和时间特异性。此外，AFP和HSA还存在许多相似之处，如整体构象相似性和多个高亲和力脂肪酸结合位点，这使得AFP有可能成为一种具有巨大潜力的药物传递系统，用于治疗某些癌症（如肝癌）。总之，本研究通过结构表征为深入研究AFP提供了基础。
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原文信息
Structural characteristics of alpha-fetoprotein, including N-glycosylation, metal ion and fatty acid binding sites---END---
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