关注我们 | 发现更多精彩内容
含有N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯的生物素化试剂被广泛用于标记蛋白质中的伯氨基（-NH2），这些伯氨基存在于赖氨酸残基的侧链以及每个多肽的N端。
对于大蛋白质而言，标记几个赖氨酸残基和N端通常不会损害蛋白质的功能或结合特性。然而，对于多肽而言，赖氨酸残基的ε-氨基随机生物素化更有可能阻碍生物素化肽下游应用所必需的结合位点功能。对多肽（尤其是短肽）中的赖氨酸残基进行标记可能会改变其功能特性和/或免疫反应性。
另外赖氨酸作为一种极性氨基酸，其侧链基团在特定条件下可以解离，带有电荷，进一步增强了与底物的相互作用。赖氨酸在某些特定蛋白质中还可能具有特殊的作用。例如，在血红蛋白中，赖氨酸可能参与维持其四聚体结构的稳定性；在某些抗体中，赖氨酸可能参与与抗原的结合等。赖氨酸在多种情况下会参与构成蛋白质的活性中心，包括作为酶活性中心的组成部分、参与底物结合与催化反应、参与维持蛋白质的空间构象以及在特定蛋白质中的特殊作用。因此如果标记量或标记位置不合适可能影响蛋白质的功能和活性。
通过使用低于NHS-酯试剂典型反应范围的反应pH值，可以实现这种优先标记。由于α-氨基的解离常数（pKa=8.9）远低于赖氨酸ε-氨基的解离常数（pKa=10.5），因此保持低于正常值的反应pH值可确保赖氨酸氨基很少处于允许其反应的未质子化状态。对于每种特定的肽，可能需要通过实验确定最佳pH值、试剂浓度和反应时间。
所需材料
• 反应缓冲液：50 mM磷酸盐（pH 6.5）或其他pH值为6.5的非胺类缓冲液。
• NHS-生物素试剂：NHS-LC-生物素或NHS-LC-LC-生物素或NHS-PEG4-生物素。其他NHS或Sulfo-NHS生物素试剂在本应用中同样可能有效。
• 用于去除和分离未反应生物素及标记肽副产物的分子排阻分离方法。脱盐柱、透析和超滤均可（需根据目标蛋白的分子量选择合适的规格）。如果要分离小分子多肽，脱盐柱和透析装置使用的树脂或膜具有低于肽分子量的分子量截留值（MWCO），则可以使用。否则，为了有效分离小分子肽、未反应生物素试剂及其副产物，必须使用高效液相色谱（HPLC）。
示例方案
• 将1-10 mg肽溶解于1 ml反应缓冲液中。最初可以使用二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亚砜（DMSO）来溶解肽，但务必确保反应缓冲液中有机溶剂的最终浓度低于20%。
• 在使用前立即准备NHS-LC-生物素在DMF或DMSO中的10 mM储备溶液（将4.5 mg NHS-LC-生物素溶于1 ml溶剂中，得到10 mM溶液）。
• 加入足够体积的10 mM NHS-LC-生物素，使溶液中的生物素摩尔量达到肽摩尔量的5倍过量。将反应混合物在4°C下孵育24小时。
• 使用透析、脱盐柱、超滤或高效液相色谱（HPLC）去除未反应的NHS-LC-生物素及反应副产物（请参阅首选缓冲液交换产品的说明书）。
• 以与非生物素化肽相同的方式存储生物素化肽。
以上为本次的分享，希望对大家有所帮助。以上内容均为个人观点，仅供大家参考。
END
⭐⭐⭐如果觉得上述内容对你有所帮助，请收藏并关注公众号。
历史文章：
Adv Exp Med Biol（IF 2.1）：铁蛋白的自组装：结构、生物功能及其在纳米技术中的潜在应用
链霉亲和素磁性微球（磁珠）的使用：游离模式和预包被模式的比较
叶酸结合蛋白（叶酸受体）的配体结合与构象结构之间的复杂相互作用：生物学视角
