叶酸结合蛋白（叶酸受体）的配体结合与构象结构之间的复杂相互作用：生物学视角

1. 介绍

高亲和力叶酸结合蛋白（FBP）调节维生素叶酸（对DNA合成和修复至关重要）的稳态和细胞内转运。膜相关FBP作为叶酸受体（FR）使叶酸内化。FR通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定连接于细胞外表面。人类FR存在三种亚型：α和β亚型带有GPI锚定，而γ亚型则没有。FRα在人类肿瘤细胞的基底外侧表面过度表达，已成为癌症治疗中极具潜力的靶点。完整细胞表面的GPI锚定蛋白以两种方式释放到细胞外液中：一种是GPI锚定被酶切后脱落，另一种是在囊泡（“外泌体”）或疏水/胶束聚集体中保留GPI锚定。在人类分泌物（例如人初乳和精液）中观察到这两种类型的释放FRα，其中带有GPI的形式可用Triton X-100增溶。

1984年首次报道了牛奶FBP的完整氨基酸序列和组成。这种相当独特的氨基酸序列代表了一个新型蛋白质家族，自那时以来，已在多种物种中鉴定出属于该家族的多种蛋白质。作为FR/FBP及其系统发育历史的例证，单细胞纤毛真核生物四膜虫（Paramecium tetraurelia）的细胞体表面配备有GPI锚定的FR。这些FR引导四膜虫向周围环境中的叶酸分子移动，从而起到化学受体的作用。

最近确定的人类FRα和FRβ的晶体结构为深入了解配体与FR相互作用的分子事件提供了深刻见解。然而，要充分了解FR/FBP的生物学功能，还需要详细分析配体结合如何影响FR/FBP在不同环境中的结构、稳定性和自缔合。

因此，本综述的目的是探讨和调查配体与FR/FBP之间复杂相互作用的各个方面，并评估其可能的生物学意义。

2.FBP的一级结构（氨基酸组成和等电点）及糖基化

2.1 一级结构

牛FBP（222个残基）的氨基酸序列是通过自动Edman测序法确定的。这是基于从牛乳清中通过阳离子交换色谱和配体（甲氨蝶呤）亲和色谱结合纯化FBP的高产纯化程序而实现的。通过沉降平衡超速离心法测定的分子量为30 kDa，而根据序列计算出的不含碳水化合物的蛋白质部分为25.7 kDa。FBP的氨基酸序列和组成在许多方面都是独特的。半胱氨酸和色氨酸的相对丰度分别为7%和5%，与大多数蛋白质中不超过2%的比例相比明显较高，而组氨酸（4%）的含量则是大多数蛋白质的两倍。这些氨基酸在FBP的结构中发挥着重要作用。因此，该分子具有16个半胱氨酸残基，形成8个二硫键，而色氨酸和组氨酸则参与与配体结合相关的重要构象变化。另一个值得注意的特点是正电荷有显著的聚集趋势，其中四肽赖氨酸21-组氨酸22-组氨酸23-赖氨酸24是最典型的例子。最近的晶体结构研究强调了这些聚集在叶酸结合中的重要作用，研究表明上述四肽构成了一个高度保守的碱性环。碱性残基的数量比酸性残基高约50%。因此，FBP是一种碱性蛋白，通过牛、人和山羊乳的等电聚焦测定，其等电点（pI）为7–9。在色谱聚焦研究中，人和牛的结合配体（全）FBP的pI具有多个值，范围为7–9，主要为7–8。出现多个pI值很可能反映了FBP不同糖基化形式的异质性（碳水化合物含量变化）。对配体结合至关重要的两个特性，即自缔合和热稳定性，其最佳pH值为在pI处（此时FBP不带净电荷）。因此，FBP的pI值接近生理pH水平，这对其生物学功能是有利的。

采用上述纯化牛FBP的方法稍作修改（用两步而非一步pH梯度洗脱亲和柱），从Triton X-100增溶的人初乳中分别制备了保留和不保留GPI锚定的FBP。这两种人FBP的N端序列在39个循环中完全相同。多项研究表明，人乳FBP与FRα相同。具有可切割GPI锚定的胶束FBP（Triton X-100胶束）与GPI连接的FRα相同。研究表明，牛和人FBP序列的N端（60个残基）之间存在高度同源性。FBP的氨基酸序列代表了一个新型蛋白质家族。迄今为止，仅有核黄素结合蛋白被报道与FBP具有一定的序列同源性，其具有8个二硫键和6个保守的色氨酸残基，核黄素的异咯嗪部分堆叠在位于87位的酪氨酸和位于173位的色氨酸之间的配体口袋中。

2.2 糖基化

糖基化是一种重要的翻译后修饰，对许多蛋白质的折叠稳定性、溶解度和功能至关重要。糖基化通过增加整个糖蛋白的分子溶剂可及表面积来提高其溶解度，这对于像无叶酸FBP这样极度疏水的蛋白质尤为重要。最初，通过聚丙烯酰胺圆盘凝胶电泳和伴刀豆球蛋白A琼脂糖色谱的结合，证明了人乳和山羊乳中的FBP是糖蛋白。山羊乳FBP含有22%的碳水化合物（岩藻糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖胺、葡糖胺和唾液酸），而牛乳FBP含有10%的碳水化合物（岩藻糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺）。在纯化的牛乳FBP中，碳水化合物含量从3%到10%不等，每摩尔含有6个葡糖胺残基，并且假设碳水化合物部分连接在第49位和第141位的天冬酰胺上。这通过胰蛋白酶消化的牛乳FBP糖肽的质谱法得到了验证，结果显示第49位（94%）和第141位（74%）发生了部分N-糖基化。通过质谱法对牛和人FBP的N-连接聚糖进行了详细的结构表征。两种FBP都含有丰富的高甘露糖杂合/复杂型N-聚糖。源自牛乳的N-聚糖大多不含岩藻糖和唾液酸，但人乳FBP中存在许多这种类型的N-聚糖。去糖基化的牛乳FBP（26.4 kDa）的MALDI-TOF质谱图包含了二聚体和三聚体峰，这与糖基化的牛乳和人乳FBP的质谱图相似。此外，对牛和人FBP的SDS-PAGE和Western印迹研究揭示了由于糖基化不同而产生的异质性双带，以及高分子量的聚集/自缔合FBP带。后一项发现与另一项研究报告的结果相似，在该研究中，通过胰蛋白酶进行胶内消化，随后进行MALDI-TOF质谱肽质量指纹分析，验证了纯化牛和人无叶酸FBP的SDS-PAGE异质性带的身份。

3.人类叶酸受体的晶体结构

最近有两篇论文报道了人类叶酸受体（FR）α和β的晶体结构。这些研究探讨了受体的不同结构方面，并详细揭示了叶酸与其受体之间的分子相互作用。此外，它们还重点关注了叶酸受体与叶酸结构类似物（抗叶酸药物）之间的相互作用。

3.1 中性pH下的叶酸受体

叶酸受体（FR）具有球状结构，由四条长α螺旋、两条短α螺旋、四条短β链以及多个环状区域组成。其三级结构由八条在所有FBP同种型以及核黄素结合蛋白中都保守的二硫键稳定。FRα在Asn 47、139和179位有三个预测的糖基化位点。与核黄素结合蛋白（与FRα有22%的序列同一性）一样，其核心结构域由四个通过四条二硫桥连接在一起的α螺旋束构成。这些结构包含长而开放的叶酸结合口袋。叶酸的蝶啶基部分深藏于带负电的口袋内部，而其谷氨酸部分的两个带负电的羧基基团则伸出至配体结合口袋带正电的入口处。围绕蝶啶基部分的氢键网络和疏水相互作用如图1A（FRα）和图1B（FRβ）所示。

图1. 叶酸在叶酸受体α（FRα）和叶酸受体β（FRβ）的配体结合口袋中的晶体结构。A，FRα。氢键用虚线表示。图片来源于《自然》杂志，经作者授权使用。B，FRβ。氢键用虚线表示，疏水相互作用用绿色实线表示，堆叠相互作用用绿色虚线表示。请注意，与FRα相比，FRβ的等效序列编号增加了+16。图片来源于《美国国家科学院院刊》的支持信息。

蝶呤环位于Tyr（Y）85和Trp（W）171的平行侧链之间，就像核黄素结合蛋白中的配体一样，并由Tyr（Y）175封闭，而蝶呤环的N和O原子与受体残基形成一系列强氢键：N1和N2与Asp（D）81的侧链羧基基团，N3和O4与Ser（S）174的羟基基团，O4与Arg（R）103和106的胍基基团，以及N5与His（H）135的侧链。主要内源性叶酸5-甲基四氢叶酸（5-MTHF）可以以与叶酸酸类似的方式结合在口袋中。

叶酸的氨苯甲酸部分通过与位于长配体结合口袋中部的Tyr（Y）60和Trp（W）102及134的疏水相互作用而稳定。

叶酸的谷氨酸残基与Trp（W）102、Lys（K）136和Trp（W）140的侧链以及His（H）135、Gly（G）137和Trp（W）138的主链相互作用形成六个氢键。

参与配体结合的大多数残基在不同亚型的FR中都是相同的，无论其来源如何，这表明观察到的叶酸结合相互作用在所有受体亚型中都是保守的。

广泛的相互作用网络使叶酸结合对单个氨基酸取代具有显著的抗性。Trp 171的丙氨酸突变使受体表达消失，表明该残基对蛋白质稳定性至关重要。除此之外，所有其他突变体都表达得相对较好。只有Asp 81的取代显著降低了亲和力，这与天冬氨酸羧基氧与蝶呤N1和N2原子的强相互作用一致。

3.2. 酸性环境下（pH 5）的叶酸受体（FR）

在酸化过程中，无叶酸结合的叶酸受体α（apo-αFR）会在四个区域发生构象变化，这些区域被称为碱性环、开关螺旋、锚定环和抑制环，如图2所示。碱性环位于第一个半胱氨酸残基之后，并包含一个保守的碱性残基四肽（括号中的编号与[11]中的序列编号相匹配）：赖氨酸41(19)、组氨酸42(20)、组氨酸43(21)、赖氨酸44(22)，即两个由赖氨酸残基包围的组氨酸残基，这一发现首先由Svendsen等人提出。在酸性条件下，碱性环会远离α2螺旋旋转，导致碱性四肽基序的侧链暴露于溶剂中。这使得开关螺旋发生位移，从螺旋状态转变为延伸的环状结构。因此，锚定环的位置也会发生移动，使得天冬氨酸51(29)和组氨酸54(32)能够参与一系列的离子相互作用。随后，抑制环通过精氨酸125(103)锚定在结合裂口处，其侧链的位置阻止了蝶啶环进入结合裂口。

图2. 在pH 5.5条件下结晶的无叶酸结合的叶酸受体α（Apo-FRα），图中标出了在低pH值下发生构象变化的环。图片来源于《美国国家科学院院刊》的支持信息。

在这个pH变化过程中，八个保守的组氨酸最有可能发生电离。碱性环中的组氨酸42和43可能由于酸性条件下电正性势的增加而改变构象。锚定环中组氨酸54(32)的移动会将精氨酸125(103)定位在叶酸结合口袋中。因此，组氨酸42、43和54似乎通过电离促进了酸性pH下的全局结构重排。

与pH 7.4相比，在pH 6.5时，叶酸结合裂口的电正性表面势显著增加。这可能会破坏复合物的结构，导致部分配体的释放。然而，目前仍不清楚在回收内涵体的pH下对叶酸亲和力的降低是否足以驱动叶酸的释放。或许需要配体结合/解离的动力学等内在因素或内涵体内的外在因素来实现叶酸的释放和转运。

在酸性内涵体中配体释放后，叶酸受体会发生重大重组，最终导致叶酸结合位点被遮蔽。如前所述，关键残基精氨酸125(103)占据结合位点的一个位置，该位置通过组氨酸54(32)介导的离子相互作用而稳定，并阻止蝶啶环进入结合裂口。

3.3. 叶酸受体与抗叶酸药物的相互作用

叶酸的结构类似物（抗叶酸药物），例如氨蝶呤（AMT）、甲氨蝶呤（MTX）和培美曲塞（PMX），对参与核苷酸生物合成的关键叶酸依赖性酶的亲和力远高于天然叶酸。它们是这些酶的强效抑制剂，能够停止核苷酸生物合成并导致细胞死亡。

抗叶酸药物进入细胞有三种途径：a–c，具体如下所述。

a) 还原型叶酸载体（RFC）是一种普遍表达的转运蛋白，是哺乳动物细胞中还原型叶酸的主要转运体；它对叶酸（氧化型叶酸）没有亲和力。

b) 质子偶联叶酸转运体（PCFT）介导膳食叶酸的肠道吸收，对还原型和氧化型叶酸具有相同的亲和力。

与RFC不同，PCFT在酸性微环境（如小肠上部和肿瘤组织中的pH 5–5.5）中作用最佳。RFC和PCFT是由400–600个氨基酸组成的跨膜蛋白，包含12个跨膜域。在生理pH下普遍表达的主要转运体RFC具有较弱的底物亲和力（μM级的Kd值）和高转运能力，这将导致抗叶酸药物产生一般毒性。

c) 高亲和力叶酸受体（Kd约0.1 nM）的组织特异性表达受限，并且在某些恶性肿瘤中过表达，使其成为避免一般毒性的抗叶酸药物选择性递送的有吸引力靶点。强效胸苷酸合酶抑制剂ONYX0801或BGC 945是基于设计对叶酸受体具有高亲和力而对RFC具有低亲和力的抗叶酸药物策略的一个例子。

在甲氨蝶呤（MTX）和氨蝶呤（AMT）中，叶酸O4被氨基取代，导致它们对叶酸受体α（FRα）的亲和力降低。该氨基无法与Arg 103和Arg 106形成氢键，并且会在叶酸结合结构中的Arg 103位置产生空间位阻（图1A）。

培美曲塞（PMX）、氨蝶呤（AMT）和甲氨蝶呤（MTX）与叶酸受体β（FRβ）的结合模式（图1B）与叶酸具有许多共同特征，尽管它们对受体的亲和力较弱。谷氨酰尾的α-羧酸盐与Gly 153、Trp 154和Trp 156形成了类似的接触。模型显示，叶酸中的蝶啶部分和培美曲塞中的吡咯并嘧啶部分以类似的方式定位于FRβ的结合裂隙中，这与甲氨蝶呤和氨蝶呤中的二氨基蝶啶部分的定位方式不同。吡咯并嘧啶部分的旋转提供了与Asp 97和His 151的极性接触，这与叶酸中观察到的接触类似。

通过设计能够利用结合裂隙内额外口袋的抗叶酸药物，可以获得对叶酸受体（FR）相对于还原型叶酸载体（RFC）和质子偶联叶酸转运体（PCFT）转运体的特异性，例如含有装饰过的三环稠合环系统的ONX801。通过设计抗叶酸药物来利用叶酸受体转运过程中的pH变化（酸性内体），可以在一定程度上克服叶酸受体有限的转运能力。这将改善配体的释放，从而使无叶酸结合的叶酸受体（apo-FR）回收至细胞表面的效率更高。Wibowo等人提出，含有具有适当pKa值的可电离基团（例如咪唑鎓部分）的抗叶酸药物将在内体中由于局部正电荷增加而更有效地释放。

本文报道了叶酸结合诱导的叶酸结合蛋白/叶酸受体（FBP/FR）构象变化。抗叶酸药物的结合是否会诱导类似的构象变化，以及这些变化在多大程度上可用于抗叶酸药物的设计，是未来研究中引人入胜的问题。

4.配体结合引起的叶酸结合蛋白（FBP）构象结构变化

配体与其受体之间复合物的形成/解离通常会引起结构变化，这些变化可能会启动/触发受体的循环/再循环或其他生物事件。因此，我们通过圆二色性（CD）、傅里叶变换红外（FT-IR）和荧光光谱法研究了配体（叶酸）结合引起叶酸结合蛋白（FBP）构象变化的可能性。

4.1. 二级结构

二级结构的变化通过圆二色性（CD）和傅里叶变换红外（FT-IR）光谱进行分析。牛源全叶酸结合蛋白（holo-FBP）在pH 5和7.4下的CD（远紫外圆二色性）光谱是相同的，并且与无叶酸结合的叶酸结合蛋白（apo-FBP）的光谱存在显著差异。正带的强度增加，最大值从192纳米移至195纳米，交叉点（199纳米）红移了2纳米，209纳米和220纳米处负带的相对强度发生了反转。二级结构分析显示，全叶酸结合蛋白中反向平行的β-链减少了10%，而α-螺旋、转角和无规卷曲则相应小幅增加。

在傅里叶变换红外光谱中，酰胺I带提供了关于二级结构的信息，其中α-螺旋和β-折叠分别在1660–1650 cm⁻¹和1640–1625 cm⁻¹范围内有贡献。与配体结合相关的光谱变化在pH 5时显示出差分光谱（有配体-无配体）中1640 cm⁻¹处有负峰，1660 cm⁻¹处有正峰，这表明β-折叠减少，α-螺旋增加。在pH 7.4下的光谱变化与pH 5.0时的相似，只是负峰的最大值出现在较低的频率（1627 cm⁻¹）下。二级结构的变化可能是由配体结合本身引起的，也可能是由配体诱导的自缔合过程引起的。在pH 5.0时全叶酸结合蛋白以二聚体形式存在，在pH 7.4时全叶酸结合蛋白以高阶多聚体形式存在，此时α-螺旋/β-折叠的比例增加更为显著。这一观察结果支持自缔合与二级结构之间存在相关性，载脂蛋白A-1的情况也是如此，其中α-螺旋度与自缔合程度成正比。

4.2. 三级结构

配体结合会改变牛源叶酸结合蛋白（FBP）的三级结构，即氨基酸侧链的空间排列。这一变化通过荧光光谱法进行了分析，利用了芳香族氨基酸色氨酸这一重要的荧光基团。其吲哚环的最大发射波长取决于微环境的疏水性，如果色氨酸残基从亲水性溶剂表面重新定向到蛋白质的疏水性内部，则波长会缩短（蓝移）。在pH 7.4和5的条件下，叶酸与FBP结合会降低色氨酸的内源荧光，同时发射最大值从346纳米蓝移至333纳米。在346纳米处，当叶酸达到饱和浓度时，荧光强度降低了4.7倍（图3和表1）。

图3. 图表展示了脱辅基FBP和全FBP在表面疏水性（橙色代表疏水表面；蓝色代表亲水表面）、色氨酸残基取向和四聚体结构（自缔合）方面的不同特性。

在另一项研究中，在pH 7.4和5的条件下，用递增浓度的叶酸对牛源FBP进行滴定，并通过平行因子分析（PARAFAC）分析了发射波长和内源荧光强度的变化。该数学模型将荧光测量的三维数据分解为潜在的荧光团以及这些荧光团与实验设计之间的关系。关键发现是出现了两个色氨酸的最大强度发射波长，分别为350纳米（红移成分，代表溶剂暴露表面的色氨酸）和330纳米（蓝移成分，代表位于蛋白质疏水性内部的色氨酸）。随着叶酸浓度达到饱和，蓝移成分的相对得分达到最大值，而红移成分则减小到最小值。

停流动力学研究通过监测内源荧光强度的降低来分析FBP与叶酸之间的相互作用。首先，配体与FBP迅速形成一个相对较弱的复合物（K=3.7 μM，pH 7.4；K=36 μM，pH 5.0），然后在毫秒内发生构象变化，形成一个更紧密的复合物。最初形成的弱复合物可能与最近两项研究中关于不可逆展开（变性）FBP的观察结果有关。这些研究报道了叶酸与FBP之间的低亲和力弱结合，且发射最大值未发生蓝移，以及叶酸可能与靠近α1和α2螺旋的空腔发生低亲和力结合。

有人可能会认为，全叶酸结合蛋白（holo-FBP）的配体诱导多聚化会导致发射最大值蓝移，因为色氨酸残基在聚集单体之间的疏水性区域中被屏蔽。在肽类物质蜂毒素的情况下确实观察到了这种效应，即从单体到四聚体的转变会使发射最大值蓝移。然而，这似乎不太可能，因为配体诱导的蓝移也发生在pH 5的条件下，此时全叶酸结合蛋白（holo-FBP，＜1μM）仅以单体形式存在。

4.3. 表面疏水性

溶剂暴露的疏水色氨酸残基向全FBP内部的重新定向，以及全FBP相较于等摩尔的脱辅基FBP具有更高的水溶性，这些都表明全FBP的表面疏水性降低。这一假设通过牛源和人源FBP的疏水相互作用色谱法得到了证实。全FBP在前端流出物中以一个放射性标记和免疫反应性峰的形式出现，而脱辅基FBP则附着在凝胶上，在向色谱柱中加入Triton X-100后才作为免疫反应性峰被洗脱出来。同样，外源性荧光非极性染料1-苯胺基萘-8-磺酸盐（ANS）也揭示了牛源全FBP的表面疏水性降低。在加入脱辅基FBP后，ANS的荧光强度增强，发射最大值蓝移，这与ANS结合到疏水环境相一致。当用全FBP替换脱辅基FBP时，ANS的荧光强度没有增强，发射最大值也没有蓝移（图3和表1）。从晶体结构（图1A和B）的外观来看，无法准确确定导致全FBP表面疏水性降低的具体过程。可能的因素包括形成氢键/极性相互作用网络，以及疏水/堆叠相互作用，这些可能与溶剂暴露的疏水氨基酸（如色氨酸）向蛋白质内部的重新定向有关。

文献中已报道了配体结合后受体和转运蛋白表面疏水性的变化及其重要的生物学意义。钙结合蛋白钙调蛋白（CaM）是一个有趣的例子，它能刺激钙敏感的磷酸二酯酶。钙离子的结合会在蛋白质表面暴露出一个疏水性的ANS结合域，该域作为蛋白质-蛋白质界面，促进钙依赖性的CaM和磷酸二酯酶之间的复合。人类钠/D-葡萄糖协同转运蛋白1（hSGLT1）是另一个例子。其表面疏水性的变化与不同的构象状态相关，可能会影响糖和钠离子的跨膜转运。底物D-葡萄糖和钠离子的结合降低了疏水性，而葡萄糖转运抑制剂根皮苷的结合则诱导了一种更适合跨膜转运的疏水性较低的构象。最近的一项研究指出了FBP表面疏水性受配体诱导变化的另一种影响。某类化疗药物（叶酸树枝状聚合物缀合物）与固定化FBP的结合是一个两步机制。第一步的关键是缀合的叶酸结合，在第二步中，缀合物的树枝状聚合物臂与蛋白质紧密接触。作者认为，缀合的叶酸最初与FBP结合会导致构象变化，暴露出亲水性表面，从而与树枝状聚合物发生不可逆的范德华相互作用。

5.配体结合诱导的FBP四级结构（自缔合）变化

FBP（无论是脱辅基还是全FBP）的四级结构或非共价自缔合是该蛋白的一个复杂且显著的特征，已在多项研究中得到探讨。

5.1 FBP在等电点（中性pH）下的自缔合

Ford等人首次在凝胶尺寸排阻色谱上报告了牛奶FBP的浓度依赖性且可逆的自缔合现象。通过一系列技术（如凝胶尺寸排阻色谱、分析型超速离心、表面等离子体共振、MALDI-TOF、SDS-PAGE-Western印迹和动态光散射）在10 nM（低于牛奶中FBP浓度的十分之一）至200 μM的浓度范围内，对牛源和人源FBP的自缔合进行了分析。这些研究揭示了脱辅基FBP在低浓度下以浓度依赖性的方式可逆地自缔合为二聚体，而在最高浓度下则形成八聚体。脱辅基FBP的多聚体具有很强的疏水性，并倾向于在水溶液中沉淀。动态光散射显示，随着温度的升高，自缔合程度降低，并在约56°C的温度下解离为脱辅基单体。在高浓度的外源性荧光非极性染料1-苯胺基萘-8-磺酸盐（ANS）存在时，自缔合受到抑制。因此，由于ANS与暴露的疏水表面相互作用，从而阻止蛋白质聚集（类似伴侣蛋白的作用），疏水相互作用（色氨酸残基？）似乎参与了自缔合过程。

配体（叶酸）的结合增强了FBP的自缔合。增加幅度可超过50%，但与叶酸相比，具有较弱结合亲和力的叶酸类似物的影响较小。全FBP的自缔合导致在1–10 nM时单体和二聚体之间达到平衡，在0.1–1 μM时形成二聚体和四聚体，在＞100 μM时形成32聚体。全FBP的多聚体具有亲水性，并且在表面等离子体共振研究中显示出比脱辅基FBP的多聚体更稳定。在SDS-PAGE-Western印迹上，全FBP呈现出异常的迁移模式，这可能表明稳定的全FBP形式能够抵抗SDS诱导的展开，因此与完全展开的蛋白质相比，其结合的SDS更少。多聚体的全FBP也比多聚体的脱辅基FBP更能抵抗加热，并在约78°C的温度下解离为单体。

人们可以推测，自缔合具有生物学意义。参与脱辅基FBP单体之间相互作用的疏水界面可以屏蔽和保护原本暴露于溶剂的结合口袋，免受物理化学/生物分解的影响。另一方面，配体的结合以及随后形成的高稳定性的全FBP复合物将确保可溶性FBP及其货物（叶酸）安全地运输到相关的目标器官，并维持细胞表面叶酸受体-叶酸复合物的稳定性。

5.2. 脱辅基FBP和全FBP的非对称自缔合

5.1节中提到的表面等离子体共振研究表明，牛源脱辅基FBP和全FBP具有可逆的、浓度依赖性的对称自缔合特性。全FBP比脱辅基FBP具有更强的自缔合倾向，且全复合物的稳定性也更高（图4）。

图4. 表面等离子体共振（SPR）测定FBP的脱辅基形式与全形式之间的对称与非对称自缔合比较。将等浓度（1 μM）的脱辅基FBP或全FBP注射到已与叶酸结合或未结合的FBP表面。实线表示固定的脱辅基FBP表面，虚线表示固定的全FBP表面。从上到下，第一条曲线（全-脱辅基FBP，红色）和第三条曲线（脱辅基-全FBP，绿色）代表非对称缔合，而第二条曲线（全-全FBP，蓝色）和第四条曲线（脱辅基-脱辅基FBP，黄色）代表对称缔合。非对称缔合产生的结合响应（自缔合增加）高于其对称对应物。数据来自参考文献[29]。

一个更为独特的发现是，脱辅基FBP和全FBP形成非对称复合物的倾向甚至更大，而这些非对称复合物至少与它们的对称对应物一样稳定（图4）。Cann提出了两种配体介导的自缔合理论模型：一种是5.1节中描述的全单体之间的对称模型，另一种是本文描述的脱辅基单体和全单体之间的非对称模型。关于非对称自缔合的表面等离子体共振数据与早期使用牛源（＜1 nM）和人源全FBP进行的凝胶尺寸排阻色谱实验之间似乎存在明显的相似之处。在后者的研究中，在Triton X-100存在下，与放射性标记叶酸结合的FBP洗脱出一个单一的单体峰。而在没有Triton X-100的情况下重复实验时，洗脱曲线不同，放射性标记叶酸的单体峰明显减弱，并出现分子尺寸更大的小放射性标记叶酸峰，这可能代表与叶酸亲和力较弱的聚集FBP。后一发现与Cann的模型一致，其中非对称二聚化将通过从反应体系中去除脱辅基单体来抑制配体结合。洗涤剂Triton X-100似乎通过减弱疏水相互作用来阻止疏水脱辅基单体和亲水全单体之间的非对称缔合（图5）。这可能是由于洗涤剂屏蔽了脱辅基单体上的疏水表面，与此一致的是，已有报道指出洗涤剂与埋藏在脱辅基FBP疏水斑块中的色氨酸残基之间存在分子相互作用。

图5.  A，假设性示意图，说明了非对称缔合对叶酸结合动力学的影响。B，叶酸与从猪血清中纯化的叶酸结合蛋白（FBP）的结合情况。空心圆表示在不添加Triton X-100的条件下，实心圆表示在添加1 g/L Triton X-100的条件下。请注意横坐标采用对数刻度。数据来自参考文献[64]。

5.3 FBP在pH值为5时的自缔合

由于阳离子FBP存在电荷排斥力，应怀疑FBP在pH值为5时自缔合会急剧减少。在高浓度FBP的分析超速离心研究中，未发现脱辅基叶酸结合蛋白（apo-FBP）的自缔合现象，而全叶酸结合蛋白（holo-FBP）则发生二聚化。在较低浓度（约10μM）的全叶酸结合蛋白进行尺寸排阻凝胶色谱分析时，仅在含氯离子的缓冲液中观察到浓度依赖性的自缔合现象，这与卤素离子能够调节蛋白质相互作用（例如可逆自缔合）的能力相一致。基础融合蛋白肽体A（pI~8.8）在pH值为5时为单体，但在向醋酸盐缓冲液中加入氯离子后会发生自缔合。据推测，卤素阴离子能够中和带正电荷的侧链的排斥力。

6 配体结合引起的叶酸结合蛋白（FBP）热折叠稳定性和抗化学变性能力的变化

脱辅基叶酸结合蛋白（apo-FBP）和全叶酸结合蛋白（holo-FBP）的折叠稳定性对于蛋白质在不同环境中的生物功能至关重要。因此，下一段将探讨这一问题。

6.1 在pH 7.4 ≈ pI时，apo-FBP和holo-FBP的热折叠稳定性

配体结合引起的热稳定性和抗化学变性能力的变化与holo-FBP的自缔合行为密切相关。

通过差示扫描量热法（DSC）分析apo-FBP的热解折叠过程，发现其熔融温度（Tm）为55°C，这一温度下apo-FBP的多聚体已解离为单体。热谱图的对称性和apo-FBP浓度影响的摩尔焓变（105 kcal/M⁻¹）排除了分子间作用力（即自缔合）对热稳定性的贡献。

配体（叶酸）的结合显著提高了折叠稳定性。除了配体结合外，浓度依赖性的分子间相互作用（即自缔合）也有助于提高holo-FBP的折叠稳定性。这体现在热谱图上升部分的明显偏斜，以及摩尔焓变和熔融温度（Tm）的增加：在3.33 μM holo-FBP时，摩尔焓变为146 kcal/M⁻¹，熔融温度（Tm）为76°C；而在浓度三倍于此的情况下，摩尔焓变增至163 kcal/M⁻¹，熔融温度（Tm）升至78°C（图6）。在78°C时，holo-FBP的八聚体已解离为单体，这意味着热解折叠和多聚体解离是同时发生的。这与表明holo-FBP对化学变性的抗性来源于配体诱导的自缔合的研究结果一致。这再次证实了不同的分子间过程参与了apo-FBP和holo-FBP的多聚化。因此，在形成高度稳定的holo-FBP亲水性多聚体的过程中，强烈的分子间作用力发挥着重要作用。

图6. 通过差示扫描量热法（DSC）测定磷酸盐缓冲液（PBS）中holo-FBP在pH值约为等电点（pI）7.4时的热解折叠过程。热转变曲线，分别为3.33 μM全叶酸结合蛋白（holo-FBP，黑色曲线）和10 μM全叶酸结合蛋白（holo-FBP，绿色曲线）。数据来自参考文献[39]。

6.2 apo-FBP和holo-FBP在pH值为5时的热折叠稳定性。氯化钠（NaCl）的影响

与pH值为7.4时相比，apo-FBP在pH值为5时的折叠稳定性显著降低。apo-FBP主要呈未折叠状态，形成多分散性聚集体，熔融温度（Tm）为38°C（接近人体温度），摩尔焓变仅为7.1 kcal/M⁻¹。考虑到apo-FBP在pH值为5时带有正净电荷（等电点pI=7–8），这些观察结果是可以解释的。蛋白质表面带有大量正电荷会导致静电排斥，这有利于apo-FBP转变为静电自由能较低（电荷密度降低）的未折叠状态。向溶剂中添加0.15 M氯化钠（NaCl）可提高折叠稳定性（熔融温度Tm为53°C；摩尔焓变为62 kcal/M⁻¹），这是由于表面电荷-电荷相互作用发生了静电屏蔽。此外，离子会增加水溶剂的表面张力和疏水性，从而增强疏水作用力并稳定蛋白质核心（霍夫迈斯特效应）。即使在存在氯化钠（NaCl）的情况下，热稳定性也明显降低，这表明低pH值本身具有热去稳定化作用。谷氨酸残基在关键位置质子化导致螺旋结构不稳定，可能是造成这一影响的合理原因。

holo-FBP的热扫描虽然表现出比apo-FBP更高的摩尔焓变和熔融温度（Tm）值，但结果呈现异质性，全holo-FBP有形成大型多分散性聚集体的明显趋势。在氯化钠（NaCl）存在下的热谱图与pH值为7.4时的热谱图相似，因为随着holo-FBP浓度的增加，熔融温度（Tm）和摩尔焓变也随之增加。这表明浓度依赖性的分子间相互作用有助于热折叠稳定性，这与在pH值为5的含氯离子缓冲液中holo-FBP的浓度依赖性自缔合现象一致。

7 配体（叶酸）结合动力学与叶酸结合蛋白（FBP）自缔合之间的相互关系

叶酸结合蛋白（FBP）最引人入胜且显著的特点是，在中性pH值（等电点pI）时，FBP的浓度依赖性自缔合与配体（叶酸）结合动力学之间存在着紧密而复杂的相互作用。已有数项研究针对这一问题展开，重点关注自缔合与配体结合如何相互干扰，从而影响FBP/叶酸受体（FR）的生物学功能。

7.1 apo-FBP和holo-FBP非对称自缔合导致的异常结合动力学

apo-FBP和holo-FBP形成高度稳定非对称复合物的倾向，可根据Cann提出的配体介导自缔合理论模型之一来解释（图5A）。该模型预测一个apo-FBP单体与一个holo-FBP单体之间会发生缔合，导致异常配体结合动力学，表现为双相滴定曲线（向上凹的Scatchard图）和不完全饱和。假设配体与apo-FBP单体的结合一直进行，直到生成的holo-FBP单体浓度达到一个临界水平，此时可能与apo-FBP单体发生非对称复合化（图5A和B），这种结合动力学就可以理解了。非对称复合化（二聚化）通过从反应体系中移除可用的apo-FBP单体来抑制结合，并且需要高浓度的配体才能通过结合释放的apo-FBP单体来逆转二聚化。图5B显示，从猪血清中纯化的FBP表现出这种异常结合动力学，而添加洗涤剂Triton X-100后则使其正常化。如第5.2节（图5）所述，Triton X-100似乎能防止疏水载脂蛋白单体和亲水全载脂蛋白单体之间的非对称缔合。从牛和人乳以及猪血清中纯化的FBP在低浓度下（主要以单体形式存在）表现出异常结合动力学。天然的洗涤剂，如胆固醇或磷脂，以及从中纯化FBP的物质（含天然脂质的环境）可以替代Triton X-100。一些体液（如血浆和精液）中高含量的胆固醇和磷脂对于高亲和力叶酸结合具有两方面的重要意义：防止可溶性FBP（1–2 nM）的非对称自缔合，以及/或者将分泌的糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接的FR增溶到胶束结构中。人体唾液是一种不含脂质和天然洗涤剂的分泌液，这可以解释为什么只有在添加至少1% Triton X-100后，放射性标记的叶酸结合才会发生。免疫反应性FBP主要是非功能性的，即使经过酸性剥离去除内源性叶酸后，也无法结合叶酸，并且其表观分子量比功能性FBP大25%，尽管它们的氨基酸组成相似。可以推测，非功能性FBP由于其表观分子量较大，代表了在缺乏天然洗涤剂的情况下生成的对酸稳定的非对称复合物。在某些条件下，生成高度稳定的非对称复合物可能是保护配体和/或其转运蛋白的一种措施，尤其是当两者浓度都较低时。

胆固醇和磷脂对于FR在细胞膜上的聚集是必要的，而胆固醇耗竭的细胞表现出叶酸摄取减少。可以推测，单个受体分子的非对称自缔合可能是导致胆固醇和磷脂缺乏时细胞FR功能障碍的多种因素之一。

7.2. 配体与单体和多聚体apo-FBP的结合

如前所述，apo-FBP和holo-FBP的自缔合体系存在显著差异。简而言之，apo-FBP自缔合形成疏水性的多聚体，而holo-FBP则自缔合形成稳定且亲水的高级多聚体。如本节所述，这两个体系以协同的方式运作，促进了配体的快速高效结合。因此，即使在apo-FBP多聚体浓度较高的情况下，结合过程也能在毫秒内完成（见图7）。

图7.  FBP在等电点（pI）处浓度依赖性自缔合机制的假设方案。Apo-FBP，橙色。Holo-FBP，蓝色。

配体与apo-FBP的结合类似于一个聚合体系，其中配体结合和浓度依赖性的蛋白质聚合（自缔合）是竞争性的，参见Cann的研究。配体对apo-单体的亲和力大于其对聚合物的亲和力（最终配体仅与单体结合）。Briehl最初在描述七鳃鳗血红蛋白的氧合作用时描述了这一体系（综述见[41]），他观察到，随着蛋白质浓度的降低（自缔合减少），配体亲和力趋于一个最大值（最小Kd或S_0.5），这个最大值出现在“无限”低浓度下，此时所有蛋白质均为单体形式。单体蛋白质与配体反应的Scatchard图呈直线（Hill系数=1），表明为非协同性结合。因此，在“无限”稀释的结合蛋白溶液中测定的结合参数是真实且准确的，因为它们不受自缔合的影响。在0.23 nM FBP（此时FBP为单体）下观察到这种类型的结合动力学，叶酸结合的Kd为22 pM，在组织中FBP/FR以相似浓度存在时也报告了这一现象，例如脉络丛。

随着apo-FBP浓度的增加和自缔合，由于可用于结合的apo-单体浓度下降，叶酸结合亲和力似乎降低（Kd增加）。配体结合会增加holo-FBP的浓度，同时减少apo-FBP单体的浓度。因此，可用的apo-单体比例相对较小，这将进一步促进聚合态的apo-FBP解离成单体（见图7）。由结合过程形成的holo-FBP单体转而具有浓度依赖性、配体介导的自缔合成更高阶且更稳定的多聚体的强烈倾向，与等摩尔浓度的apo-FBP相比。这种机制（从反应体系中移除holo-单体，以及由此导致的apo-单体）也将进一步促进apo-多聚体解离成apo-单体。随着配体结合的进行，由于可用apo-单体浓度的持续增加，表观亲和力将增加，因此Scatchard图呈现向上凸出的形状（Hill系数>1）。这也意味着在这些条件下，apo-FBP和holo-FBP的单体是自缔合过程中的中间和短暂阶段。这排除了不对称络合的可能性，并解释了为什么在高FBP浓度下添加洗涤剂是不必要的。

这两种自缔合体系的生物学意义尚待阐明。apo-FBP的可逆自缔合可屏蔽/保护相互作用疏水区域间开放且脆弱的结合位点。然而，同时自缔合也使结合位点变得不那么可及，从而降低了对叶酸的亲和力。配体结合引起FBP的构象变化，使holo-FBP能够自缔合成非常稳定的亲水性多聚体，从而有效地保护配体和FBP。

目前的数据与雌激素受体（ER）的某些性质之间存在有趣的相似之处。ER的疏水性在配体（雌二醇）结合后降低。ER二聚化并与协同性配体结合相关，这也稳定了ER的二聚化。在ER浓度较低（≤2 nM）时，配体结合变为非协同性类型（Hill系数=1），此时ER被认为以单体形式存在。

7.3 pH 5 条件下的配体结合动力学

在 pH 5 的条件下，由于表面正电荷密度较高，Apo-FBP在体温（Tm ≈ 38°C）下变得不稳定并主要处于展开状态。这一点以及 pH 5 时发生的构象变化，似乎可以解释叶酸在 pH 5 时对apo-FBP的低亲和力，以及apo-FBP在 pH 3.5–4.0 时可以被剥夺内源性叶酸的原因。在 pH 5（37°C，6 nM FBP）时，配体亲和力取决于缓冲液类型。在醋酸盐缓冲液中未发生结合，而在含氯离子的缓冲液中则达到了饱和，尽管亲和力降低了15倍。这与在0.15 M NaCl存在下，pH 5 时的折叠稳定性显著增加的结果一致。如前所述，参见第4.1节和第4.2节，在 pH 5 时研究了配体结合引起的apo-FBP构象结构的变化，但这些研究是在远低于 Tm ≈ 38°C 的环境温度（20°C）下进行的。

8 结论与展望

本综述分析了配体（叶酸）结合与FBP/FR基本结构特征之间的密切相互作用。环境因素，如pH值、脂质、洗涤剂、温度和离子，被证明对这种复杂的相互关系有剧烈影响。

FBP/FR的氨基酸序列和组成展现出了多种独特特性，这些特性适合于形成复杂的氢键/疏水相互作用和盐桥网络，从而将叶酸锚定在结合口袋中。同样值得注意的是，“碱性环”这一不寻常的四肽构型，它在pH 5时FR结构的重新排列中发挥了关键作用。FBP的碱性特性（等电点≈pH 7.4）意味着FBP的功能，特别是其结合配体和自缔合的能力，在生理pH值下达到最佳。在等电点时，apo-FBP自缔合成多聚体，通过屏蔽疏水界面保护开放的结合口袋，使其不易被配体接近。然而，加入配体会引发一系列在毫秒内完成的事件。因此，apo-FBP的多聚体会解离成单体，这些单体易于结合叶酸，并发生构象变化，形成能量上更有利且高度稳定的配体-FBP复合物。单体holo-FBP的浓度依赖性自缔合则由于强分子间力的贡献，形成了稳定性更高的亲水性多聚体。

仅在无洗涤剂样脂质的环境中，FBP浓度较低时观察到的单体apo-FBP和单体holo-FBP之间的不对称自缔合是一种奇特现象，但它可能具有生物学意义。这些极其稳定的不对称复合物的形成可能在FBP和叶酸浓度极低的情况下，保护配体和载体蛋白免受分解。

尚待解决的问题是，配体结合引起的结构变化、热稳定性和表面疏水性的改变在多大程度上会影响FBP/FR的生物功能/稳定性，例如与其他蛋白质或大分子的相互作用、通过胃肠道、吸收和穿过生物膜、运输到靶组织等。这些都是未来研究中需要解决的有趣问题。其中一个问题是低pH值下的正电表面电位，这导致热稳定性降低，并可能是引发叶酸从叶酸受体在酸性内体中释放的多个因素之一。另一个完全不同的方面是，FBP是一种具有多种有趣且迷人特征的蛋白质。其行为和性能可为其他类似蛋白质的研究提供启发性的模型。

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