Science（IF：50.5）：人心脏肌钙蛋白核心域在Ca²⁺饱和状态下的结构

【前言】在肌肉收缩过程中，力的产生与三磷酸腺苷酶（ATPase）的活性相偶联，并通过肌球蛋白亚片段1与含有肌动蛋白的肌肉细丝之间的相互作用来发挥。在骨骼肌和心肌中，收缩由细胞内钙离子（Ca²⁺）浓度来调节。20世纪60年代，Ebashi及其同事首次确定了钙离子调节的分子基础，他们发现肌钙蛋白和肌球蛋白是钙离子调节的主要蛋白。肌钙蛋白（相对分子质量约为80,000（80K））和肌球蛋白通常位于由肌动蛋白聚合而成的细丝骨架上，其比例约为肌钙蛋白：肌球蛋白：肌动蛋白=1:1:7。肌钙蛋白由三个亚基组成：TnC（钙离子结合亚基）、TnI（抑制亚基）和TnT（肌球蛋白结合亚基）。肌球蛋白在整个长度上都是α-螺旋卷曲螺旋蛋白，通过首尾相连的方式与相邻的肌球蛋白分子相互作用，形成沿着细丝连续分布的链。

TnC与TnI氨基末端片段的复合物晶体结构揭示了钙离子调节的机制。TnC由两个通过柔性连接的球状叶瓣组成。在肌细胞中，C叶瓣被认为持续与金属离子结合，并打开疏水区以结合TnI的N端两亲性α-螺旋（第一个TnC结合位点），该螺旋将TnC锚定到肌钙蛋白的其余部分，因此具有结构作用。在低钙离子浓度下，抑制区域（人类心脏TnI中的137–148号残基）与肌动蛋白相互作用，从而抑制肌动球蛋白ATP酶。基于C叶瓣结合的结构细节以及钙离子饱和的TnC结构，提出了N叶瓣中相同方式的相互作用——随着细胞内钙离子浓度的增加，钙离子与N叶瓣结合将打开疏水区以结合TnI第二个两亲性α-螺旋，该螺旋紧邻抑制区域的下游。随后，抑制区域从肌动蛋白-肌球蛋白上脱离，导致抑制作用解除。N叶瓣与TnI两亲性片段之间的相互作用通过核磁共振（NMR）研究得到了证实。

尽管TnC和TnI之间相互作用的变化在肌肉收缩开始中起主要作用这一点几乎毫无疑问，但肌钙蛋白-肌球蛋白调节肌动球蛋白ATP酶的机制仍不明确。这是因为目前仅能获得肌钙蛋白-肌球蛋白-肌动蛋白复合物很小一部分的高分辨率结构。电子显微镜和低分辨率X射线晶体学研究表明，肌钙蛋白核心域由两个结构域组成：TnT1延伸部分和其余部分。我们选择核心域作为晶体学研究的目标，因为它保留了肌钙蛋白的大部分调节功能。本文描述了两种人心脏肌钙蛋白核心域在钙离子饱和状态下的晶体结构，一种分辨率为2.6Å，另一种分辨率为3.3Å。这些晶体结构阐明了在肌钙蛋白分子内三条多肽链是如何相互折叠的。

结构测定

我们结晶了两种由大肠杆菌表达的重组人心脏肌钙蛋白亚基重构而成的肌钙蛋白核心域。其中一种核心域的相对分子质量为46K（Tn46K），由TnC(1–161)、TnI(31–163)和TnT(183–288)组成；而另一种的相对分子质量为52K（Tn52K），由TnC(1–161)、TnI(31–210)和TnT(183–288)组成。我们尝试对整个肌钙蛋白分子进行结晶，但没有成功，这可能是由于TnT1的延伸结构必须与肌球蛋白有延伸的结合位点，导致结晶失败。这两种晶体形式均在钙离子存在下生长，因此所有的金属结合位点都被占据（钙离子结合形式）。在这两种情况下，都移除了心脏特异性序列（TnI的1–30号残基），这使得每个亚基几乎与骨骼肌肌钙蛋白的对应部分相同。在Tn46K中，从TnI的C末端额外删除了46个残基（而在Tn52K中没有删除），因为这一删除改善了晶体的质量。然而，已知这种删除会损害TnI在低钙离子浓度下与肌动蛋白-肌球蛋白结合的能力。

Tn46K的结构是通过多波长反常散射（MAD）方法确定的，并基于原始晶体数据精化至2.6Å分辨率，R因子为25.9%（Rfree为29.7%）。Tn52K的结构是通过使用Tn46K结构进行分子置换确定的，并精化至3.3Å分辨率，R因子为25.1%（Rfree为30.8%）（表1）。每种晶体形式的不对称单元包含两个肌钙蛋白分子，因此我们总共获得了四个分子的结构，我们称之为Tn46KA、Tn46KB、Tn52KA和Tn52KB。

整体架构和亚基排列

Tn52KB分子的整体架构如图1a所示。值得注意的是，核心域主要由α-螺旋构成。核心域进一步分为两个结构不同的亚域（图1b），分别称为调节头部（由TnC的3–84号残基和TnI的150–159号残基组成）和IT臂（由TnC的93–161号残基、TnI的42–136号残基和TnT的203–271号残基组成）。除了两个亚域之间的相对取向外，所有四个分子都彼此相似。TnC的每个叶瓣都几乎完全重叠到先前报道的TnC-TnI二元复合物中的对应叶瓣上：蛋白质数据库代码1MXL15（TnC N叶瓣中等效钙原子之间的均方根（r.m.s.）偏差为1.50Å）和1A2X7（TnC C叶瓣中的r.m.s.偏差为1.04Å）。在两个分子中，TnI的N末端（残基31–34）都没有明确界定，而随后的残基35–42在四个分子中高度可变。残基43–79形成α-螺旋H1(I)，其两亲部分（残基43–65）通过多个极性和范德华相互作用与TnC的C叶瓣结合（这是TnI中第一个与TnC结合的部位），这一点已在TnC-TnI(1–47)二元复合物中得以证明。H1(I)的C末端部分（残基66–79）在二元复合物晶体中是无序的，但在这里通过与TnT形成多个氢键以及疏水相互作用而稳定下来（图1c）。TnI的80–89号残基保守性较差，包含两个甘氨酸和一个脯氨酸，具有伸展结构，并与TnT相互作用，形成一个疏水核心（图1c；TnI的Leu 83、Leu 85、Leu 88、Leu 93和Leu 96，以及TnT的Ala 233、Arg 230和Leu 229参与相互作用）。

H2(I)螺旋（TnI的90–135号残基）与TnT的H2(T2)螺旋（226–271号残基）形成平行的α-螺旋卷曲螺旋结构（图1），这一点之前已有报道。每条链都有6.5个七肽重复序列，a和d位置为疏水残基。参与链间相互作用的氨基酸残基即使在无脊椎动物中也高度保守，这表明TnT和TnI之间的这种卷曲螺旋结构具有对肌钙蛋白而言特征性的重要生理作用。在卷曲螺旋的C末端，TnT（256–270号残基）与TnC相互作用。

卷曲螺旋下游是TnI的抑制区域（137–148号残基）。在当前结构中，与抑制区域相关的电子密度在两个分子中都没有明确定义。然而，根据Arg 136和Thr 149之间（取决于四个分子）26.2–32.6Å的Ca距离来判断，抑制区域必须延伸，跨越13个残基。抑制区域后面是另一个两亲α-螺旋H3(I)，它跨越TnI的150–159号残基，并通过多个范德华接触与TnC的N叶瓣的疏水裂隙相互作用（TnI中的第二个TnC结合位点）。

H3(I)下游更远的区域，164–188号残基形成一个突出的α-螺旋H4(I)，它与分子的其余部分没有直接相互作用（图1a, b）。H4(I)在一个不对称单元内的一个分子（Tn52KB）中得到了明确定义，并且可能是通过与相关对称分子的H1(I)和H2(I)之间的环的最终分子接触而稳定的。另一方面，Tn52KA缺乏一个明确的突出α-螺旋，但有一个环（160–162号残基），由于Gly 160处的弯曲，其方向与Tn52KB不同（图2a）。尽管我们在这个方向上发现了Tn52KA分子中TnI的电子密度进一步扩展，但它们相当模糊，因此我们没有将这些残基纳入模型。Tn52KB的TnI的189–191号残基处于伸展结构中，最终与下一个分子相互作用，而与C末端（192–210号残基）相关的电子密度没有定义。TnT的C末端（称为C-TnT，272–288号残基），已知与肌球蛋白结合，在晶体中并不总是得到明确定义（在Tn52KB中定义到276号残基）。在卷曲螺旋上游，TnT的204–220号残基形成另一个α-螺旋H1(T2)，它相对于H2(T2)弯曲约60°（图1a, c）。H1(T2)主要通过两组氢键与分子的其余部分稳定：一组是TnT的Glu 214与TnI的Arg 98之间，另一组是TnT的Arg 216与TnI的Asp 105之间，这在Tn46KA（图1c）和Tn52KA（未显示）中都存在。然而，Tn46KB和Tn52KB缺乏这些氢键，这可能是由于晶体晶格中不同的分子堆积所致。在H1(T2)更上游的区域，TnT的183–202号残基在电子密度图中没有定义。

如上所述，与潜在肌动蛋白-肌球蛋白界面相关的电子密度大多模糊不清。这些区域包括抑制区域（Tn52KA的137–148号残基和Tn52KB的163–210号残基中的部分，以及Tn52KB的192–210号残基）和C-TnT（272–288号残基）。总体而言，Tn46K中有12.5%的氨基酸残基和Tn52K中有19.4%的氨基酸残基未纳入当前模型。这些区域缺乏与分子其余部分的直接相互作用，并且易受蛋白酶影响。因此，这些肌动蛋白-肌球蛋白结合位点可能在溶液中无法正确折叠，或者这些区域可能包含允许多种构象的柔性连接体。两种晶体形式的结构显示出相对较高的整体B因子（Tn46K的平均B因子为73.0Ų，Tn52K的平均B因子为91.7Ų），这与高角度区域衍射强度迅速下降相一致。高B因子可能源于分子在子域连接处极高的灵活性。整体高B因子以及无序区域的显著延伸可能是导致相对较高的R因子的原因。然而，实验相位的电子密度图（数据未显示）和最终的2Fo–Fc图（图1d, e）似乎具有足够的质量用于结构测定。异常的灵活性是肌钙蛋白分子的一个显著特征。由于肌钙蛋白非常灵活，分子能够长时间地避开晶体晶格中的堆积。

两个子域之间的柔性连接体

在图2中，四个分子被叠加在一起，其中调节头部（图2a）或IT臂（图2b）的取向是固定的。在这四个肌钙蛋白分子中，任意两个分子的所有等效钙原子之间的均方根偏差（r.m.s. deviations），对于调节头部来说是0.52–0.81 Å，对于IT臂来说是0.68–1.70 Å。除了Tn52KB中的环（TnI的81–89号残基）外，这四个分子中每个子域内的原子坐标几乎完全相同，这表明每个子域都作为一个整体进行运动。另一方面，这四个分子中两个子域之间的相对取向差异很大。差异最大的是Tn46KA和Tn46KB，其中IT臂相对于调节头部子域旋转了208度，导致IT臂远端发生了27 Å的位移（图2a）。

基于这一观察结果和以下考虑，我们认为两个子域之间的连接体起到了万向节的作用。首先，两个子域之间独特的共价连接，即连接TnC两个瓣叶的D/E-连接体，必须具有高度的灵活性。在我们的结构中，两个瓣叶之间的相对取向与之前报道的完全不同（图3）。在我们的研究中，由于每个分子中的D/E-连接体与分子的其余部分缺乏特异性相互作用，因此其结构并未得到清晰界定。删除D/E-连接体的TnC突变体在调节活性方面并未表现出明显的损害，而降低D/E-连接体灵活性的突变体则损害了激活细肌丝的能力。因此，D/E-连接体的灵活性（而非长度，长度会决定两个瓣叶的相对取向）对于肌钙蛋白的活性至关重要。其次，调节头部和IT臂之间的直接接触由少数残基介导，这些残基在物种间的保守性较差，因此这种接触可能并不特异，但最终会被晶体堆积力所稳定。第三，通过TnI的抑制区域（连接H2(I)和H3(I)）的连接在当前结构中并未得到很好的界定，这表明这一连接也具有灵活性。综上所述，这些发现表明，当肌钙蛋白位于肌丝上以及晶体中时，它可能会采用多种构象，且子域的取向可变。

TnC的C瓣整合

在卷曲螺旋的C末端，TnT与TnC的C瓣相互作用（图4a）。因此，肌钙蛋白的三条多肽链在这一区域汇聚，以特定的方式相互作用。在这里，螺旋H2(T2)的一侧通过形成卷曲螺旋与TnI相互作用。H2(T2)的另一侧与TnC的钙离子结合环相互作用：TnT的残基Tyr 259、Val 263、Asn 266、Arg 267和Asp 270与TnC环III中的残基Phe 101、Arg 102、Asp 105、Asp 109和Tyr 111，以及环IV中的残基Asp 149、Tyr 150和Asp 151相互作用。值得注意的是，TnT的Asp 270与TnC的Tyr 111的羟基形成了氢键，而Tyr 111的羟基同时与其羰基氧一起协同位点III中的钙离子。此外，尽管Asp 109的侧链也参与了钙离子的结合，但其羰基氧也与TnT的Asn 266形成了氢键。这些发现表明，钙离子与C瓣的结合不仅是为了保持C瓣紧密折叠以结合TnI的两亲性螺旋（TnI中第一个与TnC结合的部位），也是为了稳定TnC和TnT之间的相互作用。由于无论肌质网钙离子浓度如何，C瓣中的金属结合位点（位点III和IV）在体内都被认为是被钙离子或镁离子占据，因此C瓣牢固地整合在IT臂中，并且这种结构保持不变，与细肌丝的生理状态无关。值得注意的是，三条链的整合位点紧邻TnT的C末端区域（C-TnT，残基272–288），该区域通过锚定结构与肌动蛋白-原肌球蛋白结合，以及TnI的C末端区域（TnIreg，残基137–210），后者必须根据钙离子浓度发生主要的构象变化。

分子开关

毫无疑问，两亲性螺旋H3(I)作为分子开关，将钙离子与肌钙蛋白TnC的N瓣结合的初始信号传递给细肌丝中的其他成分，从而在基于肌钙蛋白-原肌球蛋白的调节的初始步骤中发挥核心作用。如前所述，两亲性螺旋H3(I)通过保守的疏水残基特异性地结合到钙离子饱和的TnC N瓣的疏水补丁上，并且这种相互作用依赖于钙离子。H3(I)片段位于两个假定的肌动蛋白结合位点之间，即抑制区域（残基137–148）和TnI的C末端（残基169–210），两者均被证明在无钙离子的情况下对TnI的抑制性结合至关重要，并且会根据钙离子浓度改变与附近肌动蛋白分子的距离。残基167–184高度保守，并形成两亲性螺旋H4(I)；相应的肽（骨骼肌TnI中的残基128–148）与肌动蛋白-原肌球蛋白结合，并自身表现出较弱的抑制活性。最后，在钙离子存在的情况下，TnI会从其与肌动蛋白-原肌球蛋白的结合位点上释放。因此，H3(I)与TnC N瓣疏水补丁的结合必定会导致TnI大幅延伸的C末端部分（称为TnI的调节段，TnIreg，残基137–210）从肌动蛋白丝上分离。

肌钙蛋白与其他细肌丝组分的相互作用

肌钙蛋白主要通过原肌球蛋白与TnT的两个不同部分（即TnT1和C-TnT）的结合锚定在细肌丝上。前者被认为是肌钙蛋白在原肌球蛋白上的主要钙离子不敏感锚定位点，而后者在低钙离子浓度下而非高钙离子浓度下的相互作用更强（图5）。据目前所知，IT臂的任何部分都没有与肌动蛋白或原肌球蛋白的直接相互作用。基于当前的结构，尽管TnT1和C-TnT这两部分未包含在当前的晶体结构中，但估计它们之间的距离约为60 Å（图5）。TnT1具有高α-螺旋含量且不易受蛋白水解的影响，表明它形成了另一个结构域。TnT的残基183–200可能作为两个亚域（TnT1和IT臂）之间的柔性连接体。在当前的结构中未定义此片段，其保守性较低，且易受蛋白水解的影响。

在低钙离子浓度下，TnC的N瓣会与H3(I)解离。有人认为TnI应该与细肌丝形成另一种附着，最有可能形成肌动蛋白-原肌球蛋白-TnI三元复合物，而其他研究表明TnI仅与肌动蛋白发生交联。

【讨论】

当前的结构已经阐明了肌钙蛋白分子的整体结构。肌钙蛋白似乎被划分为多个亚域，包括调节头部、IT臂、TnT1、C-TnT和TnIreg。这些亚域的边界与三条多肽链的边界完全不重合。亚域之间通过柔性连接体相连，使得整个分子相当灵活。肌钙蛋白分子的这种柔性特性必然与其生理功能相关。尽管在当前的电子密度图中许多残基仍未被识别，并且四个分子中的某些残基差异较大，但剩余部分的原子位置是可靠的，部分原因是该结构已被四次解析。实际上，缺失的残基以及四个分子中各个亚域的不同相对取向表明连接体是柔性的。这种特征结构意味着肌钙蛋白的分子运动可以用各个α-螺旋的取向变化以及各个柔性连接体的移动性来描述。

在钙调节过程中，TnIreg的位置和构象必须发生主要变化。在较高的钙离子浓度下，TnIreg从肌动蛋白-原肌球蛋白上分离，以延伸的形式与TnC的N瓣结合，如当前结构所示。在较低的钙离子浓度下，TnIreg必须与肌动蛋白-原肌球蛋白形成额外的附着，以便将肌钙蛋白-原肌球蛋白链固定在肌动蛋白丝上。在额外的附着中，整个TnIreg可能会折叠，因为完全抑制需要一个延伸的区域，至少包括残基185–210，并且如果TnIreg与七个肌动蛋白单体之一结合，那么肌动蛋白-原肌球蛋白上可用的空间可能会受到限制。

IT臂在钙调节中也必定发挥着重要作用。这个亚域体积大且刚性强，在物种间高度保守，不与肌动蛋白-原肌球蛋白直接相互作用。它的位置十分显著——这个结构连接了两个（主要）与肌动蛋白-原肌球蛋白钙离子非依赖性的附着点，即TnT1和C-TnT。此外，IT臂不仅紧邻原肌球蛋白结合位点（C-TnT），还紧邻可随钙离子浓度变化而改变位置和构象的移动性TnIreg，从而促进肌钙蛋白从两个附着点向三个附着点转变，附着在肌动蛋白-原肌球蛋白上。一个有趣的可能性是，第三个附着点（由TnIreg形成）的形成可能会导致IT臂围绕其枢轴点（即卷曲螺旋的C末端）发生微小旋转。第三个附着点本身的形成以及IT臂的旋转可能会改变肌动蛋白丝上原肌球蛋白链的性质。

这些变化的性质目前仍不得而知。尽管许多先前的研究结果都被解释为与肌球蛋白链周向位置改变的观点一致，但系统的FRET实验始终未能提供任何关于肌球蛋白与肌动蛋白之间距离发生显著变化的证据。一个更合理的解释是，肌球蛋白链所承受的应变发生了变化，从而可能改变了其移动性和/或柔性。与此观点一致的是，肌动蛋白-原肌球蛋白复合物的原子模型（不含肌钙蛋白）表明，原肌球蛋白链在肌动蛋白周围“扩散”，仅受静电力微弱地束缚。为了阐明三态模型中每个状态对应的肌钙蛋白-原肌球蛋白复合物的结构，还需要进行进一步的研究。在这方面，值得注意的是，先前对薄丝相关的X射线衍射强度以及电子显微照片的解释都是基于这样的假设：肌钙蛋白-原肌球蛋白复合物的质量在整个连续的“原肌球蛋白链”中均匀且平滑地分布。基于当前的原子结构，目前正在尝试分别确定肌肉薄丝上原肌球蛋白和肌钙蛋白的质量。

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