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【摘要】
铁蛋白是一种主要功能为储存铁的蛋白质，几乎存在于所有生物体中。我们最近的研究表明，铁蛋白可以组装成纳米颗粒。因此，我们将铁蛋白作为一种新型的重组表位疫苗递送载体。并且，我们发现铁蛋白形成的非天然聚集体对氯化钠浓度高度敏感。在此，我们报告铁蛋白是一种离子敏感蛋白，具有盐依赖性聚集的特性。我们的结果表明，在低氯化钠浓度（约50 mmol/L）下，重组铁蛋白可以从大肠杆菌中以可溶性形式释放。此外，这一结果使我们能够确定一种适当的自组装溶液，用于可溶性铁蛋白或其他基于铁蛋白的融合蛋白组装成纳米颗粒。
1. 介绍
铁蛋白是存在于所有物种中的一种蛋白质家族，其主要功能是离子螯合。铁蛋白家族能够自我组装成两种类型的蛋白质笼：大型铁蛋白（maxi-ferritin）和微型铁蛋白（mini-ferritin）。大型铁蛋白由24个亚基组成，形成类似球形的结构，外部和内部直径分别为12纳米和8纳米。这种独特的结构使得24亚基铁蛋白在作为抗原纳米载体时具有合适的特性。融合表位能否暴露在抗原载体表面是决定一种蛋白质能否成为良好抗原递送载体的关键因素。铁蛋白作为抗原载体的成功案例之一是铁蛋白-血凝素（HA）融合蛋白，它能自发组装并在其表面精细地形成8个三聚体病毒刺突。
多种纳米技术已被广泛应用于药物递送，而最近，基于铁蛋白的纳米颗粒正受到越来越多的关注。特别是，基于自组装的技术在药物递送领域已成为研究的热点。考虑到将铁蛋白作为纳米笼载体应用，需要使用不同的表达系统来获得它。铁蛋白和基于铁蛋白的融合蛋白在哺乳动物细胞、真菌和大肠杆菌中表达后，都能成功自我组装成纳米颗粒。已知铁蛋白纳米笼具有一个有趣的特性：纳米笼可以在酸性环境（pH=2.0）下分解成亚基，并且这个过程是可逆的。当pH值调回中性（pH 7.2）时，铁蛋白亚基将重新组装成纳米笼结构，且几乎保持完整。
由于不需要翻译后修饰以及铁蛋白的普遍特性，在我们的研究中，我们倾向于使用大肠杆菌这一生产异源蛋白的多功能宿主来表达铁蛋白，并开发了一个基于铁蛋白的融合蛋白表达平台。当我们在大肠杆菌中克隆和表达铁蛋白及其融合蛋白时，发现铁蛋白在沉淀中聚集。并且，这些聚集体是非共价的，这通过它们在尿素存在下迅速解离得到了证实。在探索聚集原因的过程中，本研究首次研究了铁蛋白非天然聚集体随氯化钠浓度变化的可逆相行为。我们发现裂解缓冲液中的氯化钠与铁蛋白的溶解度和自组装特性有关。
2. 材料与方法
2.1 铁蛋白融合蛋白的克隆与诱导表达
基于美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库（GenBank登录号：AE001439.1）中幽门螺杆菌铁蛋白的序列，我们设计了一对引物：Fer-f1（5'-GGATCCGGCGGTTCAAAAGACATCATTAAGTTGC-3'）和Fer-r1（5'-CTCGAGAGATTTCCTGCTTTTAGCGATC-3'），用于扩增部分DNA片段。使用幽门螺杆菌（HPss1）的互补DNA模板进行聚合酶链式反应（PCR）扩增（94°C预变性5分钟；然后94°C变性45秒，55°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，共30个循环；之后72°C终延伸10分钟，最后4°C保持）。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上分离，并使用凝胶提取试剂盒（E.Z.N.A，美国）纯化。纯化后的PCR产物在经BamHI和XhoI（Takara）酶切后，使用T4 DNA连接酶（Takara）插入到pET-28a质粒（Novagen）中。为了便于纯化，在构建的编码基因的两端构建了His标签的编码序列。
2.2 细菌超声裂解与聚丙烯酰胺凝胶电泳
将重组pET-28a/铁蛋白质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）菌株中。将铁蛋白大肠杆菌BL21（DE3）细胞在含有0.5%卡那霉素的LB培养基中于37℃培养，当OD600达到0.6时，加入0.4%异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在37℃下诱导3小时。然后，通过以8000g的离心力在4℃下离心10分钟收集最终培养物，并获取菌体沉淀。之后，将菌体沉淀分别重悬于LB培养基（含1% NaCl、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物）/裂解缓冲液（20 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA，pH 7.6）和不同浓度的NaCl溶液（0、50、100、170和300 mmol/L）中。通过超声处理（输入功率5秒/600W，间隔10秒，共40个循环）裂解细胞，然后以10000g的离心力在4℃下离心15分钟。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析上清液和沉淀物。所有经十二烷基硫酸钠染色的凝胶均使用高分辨率扫描仪（Canon Scanner 110）进行扫描。使用Magic Chemi 1D软件（Wealtec）分析凝胶图像。为了获得最佳的清晰度，通过调整参数来检测蛋白质条带。条带数据来自三次技术重复实验。
2.3 铁蛋白纯化
将铁蛋白细胞裂解的上清液加载到3 mL Ni-NTA His-Bind树脂（Merck Millipore）上。首先用10柱体积的缓冲液A（20 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑、0.03% Tween 80，pH 7.6）洗涤柱子，然后用2 mL缓冲液B（20 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑、0.03% Tween 80，pH 7.6）进行洗脱。将洗脱液加载到Sephadex G-25（Sigma）上，最后用缓冲液C（20 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、0.03% Tween 80，pH 7.6）洗涤溶液。
2.4 铁蛋白溶液透析与紫外-可见光谱观察
为确保纯化的铁蛋白保持单体形式，将缓冲液C的pH值调节至2.0。然后，将变性的蛋白质均匀分配，并在4℃下于缓冲液D（20 mmol/L Tris-HCl、0.03% Tween 80、pH 7.6，NaCl浓度为50/100/170/300 mmol/L）中进行透析。透析后，将含有不同NaCl浓度的蛋白质溶液置于1 cm²的石英比色皿中，以监测其光密度。在波长为650 nm处测定光密度。
2.5 透射电子显微镜观察
准备缓冲液C和含有50至300 mmol/L NaCl的缓冲液D中的铁蛋白溶液，用于透射电子显微镜（TEM）测量。将数微升溶液滴加在涂有碳膜的网上，去除多余溶液。样品用1%硫代葡萄糖金进行负染色，并通过TEM进行观察。
2.6 结果
2.6.1 不同超声介质对铁蛋白特性的影响
为从大肠杆菌中获取铁蛋白，样品在LB培养基中经超声处理。随后，对裂解物进行离心，并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析上清液和沉淀物。结果发现，铁蛋白以聚合物的形式出现在沉淀中（图1）。铁蛋白是一种自然形成纳米颗粒的蛋白质，本应溶于上清液中。于是，我们将超声介质改为裂解缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L Na2EDTA、1 mmol/L乙二醇四乙酸[EGTA]、1% Triton X-100、2.5 mmol/L焦磷酸钠、1 mmol/L甘油磷酸钠、1 mmol/L Na3VO4、1 mg/mL亮抑酶肽），并重复上述步骤。有趣的是，这次铁蛋白出现在上清液中（图1）。这些数据表明，LB培养基中的成分（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl）导致铁蛋白沉淀。然后，我们分别使用1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和1% NaCl（170 mmol）作为超声介质来裂解细菌。结果显示，胰蛋白胨和酵母提取物对铁蛋白的溶解度影响很小，而1% NaCl（170 mmol）导致50%的铁蛋白沉淀。相比之下，我们分别使用LB培养基和裂解缓冲液检测了鞭毛蛋白的特性及其可溶性表达。同时，我们还检测了VP1的特性作为阴性对照，VP1在LB培养基和裂解缓冲液中均出现在沉淀中；以及检测了鞭毛素作为阳性对照，鞭毛素在LB培养基和裂解缓冲液中均出现在上清液中（表1）。这些结果清楚地表明，铁蛋白是一种对离子敏感的蛋白质。
图1. 细菌细胞超声破碎后铁蛋白在可溶性组分与聚集组分中的SDS-PAGE分析。
注：铁蛋白在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中过量表达。本研究使用了5种介质作为超声缓冲液：LB培养基、裂解缓冲液、1%胰蛋白胨、5%酵母提取物和1% NaCl。在此图中，可以观察到铁蛋白的可溶性和聚集状态。超声破碎后，不溶性样品中可观察到更高比例的聚集物（n=3）。LB培养基-超声后呈不溶形式；裂解缓冲液-超声后呈可溶形式；1%胰蛋白胨-超声后呈可溶形式；5%酵母提取物-超声后呈可溶形式；1% NaCl-超声后呈不溶形式。S-上清液；P-沉淀。
2.6.2 NaCl浓度对铁蛋白特性的影响
离子强度被认为在蛋白质的组装和稳定性中起着关键作用。为了研究这一点，我们在裂解缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L Na2EDTA、1 mmol/L EGTA、1% Triton X-100、2.5 mmol/L焦磷酸钠、1 mmol/L甘油磷酸钠、1 mmol/L Na3VO4、1 mg/mL亮抑酶肽；图2A和B）中改变NaCl的浓度（0、50、100、170、300 mmol/L）。数据表明，在NaCl浓度为0 mmol/L时，约100%的铁蛋白以可溶性形式释放。在NaCl浓度为50至170 mmol/L时，几乎有50%的铁蛋白处于沉淀状态。然而，在NaCl浓度较高（300 mmol/L）时，铁蛋白蛋白以聚集形式存在。我们仍然使用鞭毛素和VP1作为对照，在NaCl浓度为300 mmol/L时，鞭毛素约100%以可溶性形式释放。口蹄疫病毒（FMDV）的表位已得到广泛研究。VP1衣壳蛋白已被证实携带有诱导免疫反应的关键表位，包括1个主要B细胞表位和2个T细胞表位。FMDV中最主要的B细胞表位跨越141至160位氨基酸残基，并且高度暴露于病毒粒子的表面。针对该环的抗体反应能够中和FMDV。本实验室已构建了VP1的重组蛋白，并且大部分在大肠杆菌中以包涵体的形式表达。鞭毛素是鞭毛毛丝的成分抗原。该蛋白暴露于细菌表面，可供B细胞识别，可以高水平表达，并且是T细胞对鼠伤寒沙门氏菌（STm）反应的重要靶标。此外，本实验室已构建了鞭毛素的重组蛋白，并且在大肠杆菌中以可溶性形式表达。这些结果表明，铁蛋白具有盐依赖性聚集的特性。图2C中的一系列数字图像显示了不同NaCl浓度的代表性示例，有助于将透射率百分比与滴定过程中肉眼可见的结果相对应。
图2. NaCl浓度对铁蛋白特性的SDS-PAGE分析。
注：A. 铁蛋白在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中过量表达。研究了不同浓度的NaCl：0、50、100、170、300mM。在此图中，可以观察到铁蛋白的可溶性和沉淀状态。在NaCl浓度为0mM时，100%的铁蛋白以可溶性形式释放。在NaCl浓度为50-170mM时，约有50%的铁蛋白处于沉淀状态。在NaCl浓度较高（300mM）时，铁蛋白以聚集形式存在。当溶液中存在0.5M尿素时，即使NaCl浓度达到500mM，铁蛋白仍以可溶性形式释放。S-上清液；P-沉淀。B. 不同浓度的NaCl显示了沉淀中铁蛋白聚集物数量的增加（n=3）。C. 不同NaCl浓度的代表性示例。每张数字图像上都标明了近似的透射率百分比。
2.6.3 不同NaCl浓度溶液中铁蛋白的透射率百分比
我们使用NaCl作为不同浓度铁蛋白的沉淀剂。结果表明，盐依赖性浊点的位置对总蛋白浓度敏感。也就是说，蛋白浓度越高，转变越容易发生，即在较低的盐浓度下即可发生。图3显示了清晰的浊点转变，类似于图2C中的pH正向滴定。图2C和图3的一个显著特征是转变位置对铁蛋白的敏感性。从物理角度来看，这是阻止聚集体合并的主要驱动力，而相分离则是由于聚集体分子之间的静电斥力，这一点之前已根据聚集体浊点的孤立结果提出过。图3中的一系列数字图像显示了仅缓冲液条件下正向滴定曲线上不同点的代表性示例，有助于将透射率百分比值与滴定过程中肉眼观察的结果相对应。
图3. 三种不同总聚集体浓度（10 mg/ml（圆圈）、5 mg/ml（方块）和1 mg/ml（菱形））下铁蛋白聚集体浊点的NaCl滴定。
注：箭头指示滴定方向。
2.6.4 铁蛋白纳米复合材料的电磁波吸收性能
为了表征在低浓度和高浓度NaCl条件下铁蛋白纳米粒子的形态，采用透射电子显微镜（TEM）对样品进行了观察。在低浓度NaCl处理（≤50 mmol/L）的样品中，可以观察到直径为10.5至13纳米（平均12纳米）的纳米粒子，而在高浓度NaCl处理（100-300 mmol/L；图4）的样品中则未检测到这些结构。这些结果清楚地表明，较低的NaCl浓度（≤50 mmol/L）可以促进铁蛋白形成纳米粒子。
图4. 铁蛋白制剂的电子显微照片。
注：含有不同NaCl浓度（0 - 300 mM）的蛋白溶液用1%硫代葡萄糖金进行负染色，并使用80KV透射电子显微镜（TEM）进行观察。
2.7 讨论
铁蛋白的结构特性，尤其是其装载外源性肽的能力，使其成为构建多功能纳米融合蛋白的强大潜在平台。铁蛋白基融合蛋白作为疫苗的优势体现在两个方面：一是肽的识别频率增加，二是融合蛋白的体积足够大，能产生强烈的免疫原性，这使其有望成为成功的疫苗。在我们的研究中，无论是铁蛋白本身还是基于铁蛋白的融合蛋白，都能组装成纳米粒子，这为融合蛋白成为有效疫苗奠定了基础。
在细菌超声裂解过程中，我们发现无论使用何种超声介质（LB或裂解缓冲液），一种蛋白质总会产生相同的结果。如果铁蛋白出现在上清液中，则被视为可溶性表达，如鞭毛蛋白。如果铁蛋白在沉淀中，则被视为聚集性表达，如VP1。因此，当我们在实验室进行小规模试验以观察在大肠杆菌中表达的蛋白质的溶解性时，为了操作方便，通常直接对LB中的细菌进行超声裂解。直接使用LB作为超声介质时，发现铁蛋白作为一种聚合物出现在沉淀中。考虑到铁蛋白的普遍存在特性，并参考了与铁蛋白表达相关的文献，这些文献报道铁蛋白在大肠杆菌中可溶性表达，我们猜测一定存在一些可调节的元素，通过改变这些元素可以获得可溶性铁蛋白。我们调整了培养基的营养成分、pH值、诱导温度，并最终聚焦于超声介质。在降低超声介质中NaCl浓度后，铁蛋白在上清液中呈可溶性。结果表明，与其他蛋白质不同，铁蛋白对环境中的离子强度非常敏感。如果使用LB作为超声介质，会导致大肠杆菌中铁蛋白错误地呈现为聚集性表达。然后，我们设计了一系列在裂解缓冲液中溶解的NaCl浓度，分别为300 mmol/L、170 mmol/L、100 mmol/L、50 mmol/L和0 mol/L。其中，170 mmol/L的浓度相当于NaCl的1%质量百分比浓度，这与LB中的成分相同，旨在模拟铁蛋白在LB中经历的相同离子强度。与170 mmol/L相比，300 mmol/L对铁蛋白而言是一个相对较高的浓度，会导致其聚集。100 mmol/L是根据《分子克隆》第三版中裂解缓冲液的常规选择。50 mmol/L NaCl对铁蛋白而言是一个相对较低的浓度，会使其呈可溶性。0 mmol/L NaCl用作空白对照。我们的结果表明，在铁蛋白相关蛋白质的纯化和组装过程中，NaCl的浓度应低于100 mmol/L。我们在后续实验中选择的NaCl浓度为50 mmol/L，这已被证明是铁蛋白本身和基于铁蛋白的融合蛋白成功复性的良好选择。但是，对于那些在大肠杆菌中呈聚集性表达的蛋白质，即使调整了超声介质中的离子强度，它们的聚集状态也无法改变，如图1中的VP1所示（作为阴性对照）。
盐与蛋白质的相互作用调控着蛋白质的溶解度和稳定性，特别是在盐析和聚集过程中。在生理条件下，盐的存在会触发分子内的折叠事件，诱导形成正确的肽链结构。圆二色性光谱显示，在无盐存在的条件下，肽链在pH 7.4时呈未折叠状态。通过提高溶液的离子强度，肽链内带电氨基酸之间的静电相互作用被屏蔽，肽链采取疏水构象。在相对较高盐浓度下，疏水相互作用占据主导地位，导致化学交联的聚合物链沉淀。研究表明，盐浓度的变化不仅通过形成蛋白质中间体（即肽链）来诱导聚集，还通过电荷屏蔽和各种溶剂化力来诱导聚集。正是这种蛋白质二级结构与溶剂化力之间的复杂相互作用，导致了盐触发的聚集现象。
在后续实验中，我们发现当溶液中存在0.5 mol/L尿素时，即使NaCl浓度为500 mmol/L，铁蛋白仍然保持可溶性。这是因为尿素可以改变铁蛋白表面的电荷分布，从而提高其溶解度。然而，0.5 mol/L尿素可能对蛋白质活性产生轻微影响，因此我们可以尝试将NaCl浓度调整至适当范围（<100 mmol/L），以促进在无尿素存在下铁蛋白的自组装过程。铁蛋白对盐依赖的聚集特性为我们寻找适合铁蛋白及其他基于铁蛋白的融合蛋白自组装的溶液提供了理论基础。同时，这也提醒我们，一些经验方法可能会在科学研究中导致误导性的结果。
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原文信息:
Sun W, Jiao C, Xiao Y, et al. Salt-Dependent Aggregation and Assembly of E coli-Expressed Ferritin. Dose Response. 2016;14(1):1559325816632102. Published 2016 Feb 26. doi:10.1177/1559325816632102
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