Biosens Bioelectron（IF 10.7）：基于成像传感器阵列与双信号放大策略的多重霉菌毒素超灵敏化学发光免疫分析

1. 介绍

随着中草药（HM）的国际化，霉菌毒素污染已成为全球关注的焦点（Wang等人，2015；Steinhoff，2019）。霉菌毒素通常被认为是各种真菌产生的次生代谢产物，在生长、收获、加工、运输和储存过程中经常污染谷物中草药和食品，即使在超低浓度下也被证明具有致癌性、免疫抑制性、肝毒性、肾毒性和神经毒性（Follmann等人，2014；Chauhan等人，2016；Magro等人，2016；Zhang等人，2017）。国际监管机构已制定了严格的霉菌毒素残留标准，低至微克每公斤（Zhang等人，2018a；Liu和Ying等人，2019）。例如，《欧洲药典》10.0版和《美国药典》2020版分别将黄曲霉毒素B1（AFB1）的最大残留限量设定为2μg/kg和5ppb。迫切需要建立高灵敏度的多种霉菌毒素联合检测方法，以满足中草药质量和安全的要求。

近年来，已开发出各种分析技术来监测霉菌毒素的水平，如高效液相色谱结合荧光检测器（HPLC-FLD）（Kong等人，2018）、液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）（Marino-Repizo等人，2015）、酶联免疫吸附试验（ELISA）（Zhang和王等人，2017；Zhang等人，2018b）、荧光免疫分析（Li等人，2016；Chen等人，2020；Qian等人，2020）、电化学生物传感（Zhu等人，2020）、光化学生物传感（Feng等人，2020）和基于表面增强拉曼散射的免疫分析（Wang等人，2018）。尽管HPLC-FLD和LC-MS/MS具有高灵敏度、高特异性和可靠的结果，但它们需要复杂的样品预处理、专业操作和高昂成本，极大地限制了现场检测。免疫分析方法应用广泛，但大多用于单组分分析或需要复杂设备。

化学发光（CL）免疫分析，特别是基于传感器阵列的方法，由于无需外部光源和简单的光学设备而引起了广泛关注（Liu等人，2016；Yue等人，2017；Kong等人，2019；Xiao和Xu，2020）。然而，化学发光信号的读取总是受到量子场有限的困扰（Roda等人，2016；Cohen和Walt，2019）。为了克服这一缺陷，信号放大技术受到了极大关注（Lei和Ju，2012）。之前，从化学发光传感器的角度出发，我们构建了银纳米粒子修饰的免疫传感器用于金属增强的化学发光（Jiang等人，2020），而在这里，我们从化学发光标签的角度出发，寻求更高的灵敏度和更好的分析性能。

最近，一种名为酪胺信号放大（TSA）的酶介导系统已被应用于蛋白质、核酸和细胞的电化学分析（Hou等人，2014；Liu和Li等人，2019；Zhou等人，2019）。在辣根过氧化物酶（HRP）和过氧化氢（H2O2）的存在下，酪胺可以转化为短寿命的中间体，该中间体共价结合到相邻的蛋白质残基上并在蛋白质周围沉积。随后，通过亲和素-生物素反应积累更多的HRP，导致信号放大（Boguszewska等人，2019）。这启发我们将TSA系统引入被多个HRP包裹的金纳米粒子（AuNPs）（Zong等人，2012）中，并将这种双重信号放大策略应用于化学发光分析。通过使用涂有不同牛血清白蛋白（BSA）结合霉菌毒素的一次性免疫传感器阵列，开发了一种新型的超灵敏化学发光成像方案，用于同时检测谷物中草药中的多种霉菌毒素。

由于具有调节血脂水平、高血压和血糖等多种药理活性，红曲（RYR）已被用作药物和食品数百年（Gu等人，2019）。由于霉菌毒素容易在谷物中草药中产生，因此受众广泛的红曲可作为模型分析物（Magro等人，2016；Gerards等人，2015；Banach等人，2018）。选择了可能存在于红曲中的黄曲霉毒素B1（AFB1）、赭曲霉毒素A（OTA）和橘霉素（CIT）作为概念验证。作为一类致癌物，AFB1是最有效的肝毒素、致癌物、致畸物和诱变物之一（IARC，2012）。OTA是赭曲霉毒素中毒性最强的，主要引起肾脏损伤，也是最致癌的物质之一（Marino-Repizo等人，2015；Feng等人，2020）。CIT是一种肝肾毒性霉菌毒素（Huang等人，2019）。由于其可怕的危害和协同作用，多重和痕量检测势在必行。

实验结果表明，双重信号放大策略显著提高了化学发光的灵敏度（同时检测3种霉菌毒素的信号放大了50-57倍，检测限低至亚皮摩尔水平）。此外，所提出的通用传感平台简单、试剂消耗低、稳定性和准确性高，适用于霉菌毒素的联合分析。

2.材料与方法

2.1. 材料

醛基修饰的玻璃芯片购自中国上海瑞迈生物技术有限公司，用于制备多组分免疫传感器阵列。黄曲霉毒素B1（AFB1）、赭曲霉毒素A（OTA）和橘霉素（CIT）等霉菌毒素，AFB1-BSA、OTA-BSA和CIT-BSA等牛血清白蛋白（BSA）结合的霉菌毒素，含有AFB1-mAb、OTA-mAb和CIT-mAb的单克隆抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记的捕获抗体（HRP-IgG）和IgG均购自中国山东省滨州市绿都生物科技有限公司。HRP购自中国上海阿拉丁生化科技股份有限公司。化学发光底物（鲁米诺-对碘苯酚和H2O2）购自中国北京凯博生物技术有限公司。链霉亲和素-HRP购自中国北京索莱宝科技有限公司。生物素-酪胺购自美国德克萨斯州休斯顿APExBIO科技有限公司。BSA购自中国安徽省合肥市博锐生物科技有限公司。氯金酸（HAuCl4·4H2O）购自美国密苏里州圣路易斯西格玛奥德里奇化工公司。柠檬酸钠（C6H5Na3O7·2H2O）购自中国北京国药集团化学试剂有限公司。HAuCl4·4H2O和C6H5Na3O7·2H2O用于合成金纳米粒子（AuNPs）。磷酸盐缓冲液（PBS）粉末（即用型）购自中国上海生工生物工程股份有限公司，并用超纯水溶解制备PBS缓冲液（0.01 M，pH 7.4）。Na2CO3-NaHCO3缓冲液（0.05 M，pH 9.6）购自中国江苏省南京市森贝生物科技有限公司。PBS和Na2CO3-NaHCO3缓冲液均用作偶联缓冲液，用于将AFB1-BSA、OTA-BSA和CIT-BSA固定在玻璃芯片上。PBS缓冲液还用作其他溶液的稀释缓冲液。含有5% BSA的PBS用于封闭免疫传感器阵列上剩余的活性位点。二甲基亚砜（DMSO）购自中国上海泰坦科技股份有限公司，并用于制备生物素-酪胺储备液。30% H2O2购自中国江苏省南京市化学试剂有限公司，并用0.003% H2O2稀释生物素-酪胺储备液。根据《中国药典》（中国药典委员会，2020）和《食品安全国家标准》（中华人民共和国国家卫生健康委员会，2016a，b）中检测霉菌毒素的测定方法，选择70%甲醇作为一步法高效提取红曲样品中多种霉菌毒素的最佳溶液，且基质干扰最小。为了减少有机溶剂对化学发光免疫分析的影响，提取液的稀释倍数设定为5倍。同样，70%甲醇经PBS 5倍稀释后也用于制备标准溶液。整个测定过程中均使用美国马萨诸塞州米尔福德密理博公司的Milli-Q水纯化系统提供的超纯水（≥18 MΩ cm）。其他所有试剂均为分析纯，并按原样使用。

2.2. 仪器

使用日立（日本东京）Regulus 8220扫描电子显微镜（SEM）获取了牛血清白蛋白（BSA）结合霉菌毒素修饰前后的成像传感器阵列的扫描电子显微图。使用日本电子（日本东京）JEM-200CX透射电子显微镜（TEM）捕获了金纳米粒子（AuNPs）的透射电子图像。使用中国浙江省杭州市奥盛仪器有限公司的Nano-100微型分光光度计和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆珀金埃尔默公司的LAMBDA 365分光光度计记录了AuNPs的紫外-可见（UV-vis）光谱。后者还用于计算AuNPs的直径和浓度。使用中国浙江省杭州市奥盛仪器有限公司的Nano-100微型分光光度计记录了辣根过氧化物酶（HRP）@AuNP-IgG的UV-vis吸收光谱。使用中国陕西省西安市雷玛克斯公司的IFFM-E发光分析仪，通过静态方法研究了化学发光（CL）反应的动力学行为。使用包括高分辨率冷却低光电荷耦合器件（CCD）相机的生物分析成像系统（美国加利福尼亚州都柏林Azure Biosystems公司）进行了CL成像和信号采集。

2.3. 多组分免疫传感器阵列的制备

多组分免疫传感器阵列以3行×12列的格式（方案1）制备了36个传感位点。每一行分别用橘霉素-牛血清白蛋白（CIT-BSA）、黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白（AFB1-BSA）和赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白（OTA-BSA）进行修饰。所提出的多组分免疫传感器阵列可同时用于检测12个样品中的3种霉菌毒素。

简而言之，将一层含有36个孔（直径为4毫米，边缘间距为1毫米）的光非活性薄膜手动粘贴在玻璃芯片上。形成的36个传感位点可用作储液池，用于排列免疫分析所需的溶液。然后，将7.0μL的CIT-BSA（浓度为0.275μg/mL）、AFB1-BSA（浓度为0.25μg/mL）和OTA-BSA（浓度为0.35μg/mL）分别涂覆在相应的行上，并在4℃下避光孵育过夜。洗涤并干燥后，加入7.0微升的封闭缓冲液，并在室温（RT）下避光孵育1小时，以封闭未反应的醛基。再次洗涤并干燥后，多组分免疫传感器阵列制备成功，并在使用前于4℃下储存。所有洗涤步骤均使用洗瓶以超纯水洗涤三次。

方案1. (A) 基于双信号放大策略的化学发光免疫传感过程的示意图，以及 (B) 使用一次性多组分免疫传感器阵列对3种霉菌毒素进行化学发光成像免疫分析的示意图。

2.4. HRP@AuNP-IgG生物缀合物的制备

AuNPs的合成根据之前的文献（Iglesias-Mayor等，2020）进行。将100mL 0.01%的HAuCl4水溶液在持续搅拌下加热至沸腾。然后，在持续搅拌的同时，迅速将2.5mL 1%的三钠柠檬酸盐溶液逐滴加入到沸腾的溶液中。溶液由灰黄色变为深红色，表明AuNPs已成功制备。随后，在搅拌下将溶液冷却至室温，并在4℃下储存以供后续使用。

HRP@AuNP-IgG生物缀合物根据之前的方案（Zhong等，2019）进行制备，并将该方案中的抗体替换为IgG，以用于霉菌毒素的检测。简而言之，将10μL 100μg/mL的IgG和24μL 5.0mg/mL的HRP迅速加入到1.0mL pH调整为9.0的AuNP溶液中。然后，在轻微搅拌下反应2小时，形成HRP@AuNP-IgG生物缀合物。通过在4℃下以10000转/分钟的速度离心30分钟，去除过量的IgG和HRP。最后，将沉淀物分散在1.0mL含有1%BSA的0.01M PBS中，并在4℃下储存，以备使用。

2.5. 化学发光免疫分析中的样品预处理

从中国不同地区（中国安徽省亳州市、中国河北省安国市和中国浙江省丽水市）收集了三批肉苁蓉（RYR）样品。将肉苁蓉样品用搅拌机研磨成粉。然后，准确称取每批样品2.5g粉末（24目），加入到10mL 70%甲醇溶液中，再加入0.5g氯化钠，随后在37℃下振荡30分钟。将提取液在5000转/分钟的速度下离心30分钟。将上清液用70%甲醇溶液稀释100倍，再用0.01M PBS缓冲液稀释5倍，最后通过0.45μm滤膜过滤，以去除不溶性杂质，供化学发光免疫分析使用。

2.6. 基于双信号放大的多种霉菌毒素化学发光免疫分析

双信号放大策略基于多酶包裹的金纳米颗粒（AuNPs）和酪胺信号放大（TSA）技术（方案1）。为了获得橘霉素（CIT）、黄曲霉毒素B1（AFB1）和赭曲霉毒素A（OTA）的校准曲线，将3.5μL标准溶液稀释至一系列浓度，与3.5μL相应的单克隆抗体（mAbs）（CIT-mAb 0.53μg/mL、AFB1-mAb 0.85μg/mL和OTA-mAb 0.75μg/mL）一起加入到对应行的传感位点，并在室温下孵育30分钟。洗涤并干燥后，向传感位点加入7.0μL的HRP@AuNP-IgG生物缀合物，并孵育30分钟，然后再次洗涤并干燥。接下来，向传感位点加入7.0μL的生物素-酪胺（1mM），并孵育15分钟，之后洗涤并干燥。之后，向传感位点加入7.0μL的链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP，2.0×10^-4mg/mL），并孵育30分钟，然后洗涤并干燥。最后，向传感位点加入7.0μL的化学发光（CL）底物，以触发化学发光反应。为了检测肉苁蓉（RYR）真实样品中的多种霉菌毒素，将10.5μL的样品溶液分为三份，并加入到一列中的三个传感位点，执行相同的程序。

所有传感位点的化学发光信号均由电荷耦合器件（CCD）相机以十次6秒的曝光时间进行动态积分1分钟的同时采集。图像使用GraphPad Prism 8、OriginPro 2019和Photoshop CS软件进行处理。每个点的化学发光强度计算为每个点中心周围给定半径圆内的平均像素值。

2.7. 霉菌毒素检测的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法

实际样品中橘霉素（CIT）、黄曲霉毒素B1（AFB1）和赭曲霉毒素A（OTA）的参考检测采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，该方法使用安捷伦1290与6460电喷雾离子化三重四极杆（ESI-QQQ）质谱系统（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托市安捷伦科技公司）。使用安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（2.1×50mm，1.8μm）进行优化分离，流动相由含0.1%（v/v）甲酸的水溶液（A）和甲醇（B）组成。梯度洗脱程序优化如下：0-5.5分钟内B相从25%升至80%，5.5-7分钟内B相从80%升至100%，7-8.5分钟内保持100%的B相，8.5-9.5分钟内B相从100%降至25%，流速为0.2毫升/分钟。质谱检测器的条件优化如下：雾化气流速为3升/分钟；加热气流速为10升/分钟；鞘气温度为300℃；气体温度为350℃。采用多反应监测（MRM）模式进行MS/MS检测，优化的离子对如下：CIT为m/z 249.1→205.1，AFB1为m/z 313.1→285.1，OTA为m/z 402.1→358.1。

3.结果与讨论

3.1. 免疫传感器阵列的特性表征

采用扫描电子显微镜（SEM）对免疫传感器阵列的制备进行特性表征。原始的醛基修饰玻璃芯片呈现出光滑且均匀的表面（图1A）。在固定黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白（AFB1-BSA）后，可以观察到明显的蛋白质生物分子聚集，这表明牛血清白蛋白与霉菌毒素成功结合修饰在了玻璃芯片上（图1B）。这与先前的研究结果一致（Zhong等，2019）。

图1. 扫描电子显微镜图像：(A) 原始玻璃芯片 和 (B) AFB1-BSA修饰后的芯片

3.2. 金纳米粒子（AuNPs）和辣根过氧化物酶@金纳米粒子-免疫球蛋白G（HRP@AuNP-IgG）生物偶联物的特性表征

采用紫外-可见分光光度计和透射电子显微镜（TEM）对金纳米粒子（AuNPs）进行特性表征。根据金纳米粒子在表面等离子体共振峰（Aspr）处的吸光度与450纳米（A450）处吸光度的比值，估算出金纳米粒子的平均尺寸为14nm，且计算出金纳米粒子的浓度为4.03 nM（Haiss等，2007）。金纳米粒子的TEM图像显示，其呈现分散的球形结构，平均尺寸为14.95nm（图2A和B），这与紫外-可见分光光度计的结果一致。

图2. (A) 金纳米粒子（AuNPs）的透射电子显微镜图像和(B) 金纳米粒子粒径分布的统计图，以及(C) 金纳米粒子（黑色线）和辣根过氧化物酶@金纳米粒子-免疫球蛋白G（HRP@AuNP-IgG，红色线）的微紫外-可见光谱图。

采用微紫外-可见分光光度计研究金纳米粒子和辣根过氧化物酶@金纳米粒子-免疫球蛋白G（HRP@AuNP-IgG）的光谱特性。金纳米粒子的吸收峰位于516纳米（图2C，黑色曲线），而辣根过氧化物酶@金纳米粒子-免疫球蛋白G的吸收峰则发生了红移（图2C，红色曲线），这表明在金纳米粒子-免疫球蛋白G生物偶联物形成过程中，金纳米粒子发生了轻微聚集。此外，辣根过氧化物酶@金纳米粒子-免疫球蛋白G的微紫外-可见光谱在277纳米处还呈现另一个强吸收峰，这是蛋白质的典型吸收峰，表明蛋白质与金纳米粒子成功结合（图2C，红色曲线）。

3.3. 双化学发光（CL）信号放大

为了评估多辣根过氧化物酶（HRP）包裹的金纳米粒子（AuNPs）和酪胺信号放大（TSA）技术的放大能力，我们在相同条件下，分别对基于HRP-免疫球蛋白G（IgG）、HRP@AuNP-IgG以及HRP@AuNP-IgG结合TSA技术（使用生物素-酪胺和链霉亲和素-HRP）的化学发光免疫分析法进行了测试，用于检测0.01 ng/mL的黄曲霉毒素B1（AFB1）。如图3A–C所示，HRP@AuNP-IgG生物偶联物催化的化学发光强度是单独使用HRP-IgG的4.8–5.0倍，这与先前的研究结果相似（Zong等，2012）。当同时使用HRP@AuNP-IgG和TSA技术时，化学发光强度进一步增加了10.3–11.4倍。因此，这种双重放大策略使得同时检测这三种霉菌毒素时的化学发光信号提高了50–57倍。

图3. 基于（1）HRP-IgG，（2）HRP@AuNP-IgG，和（3）HRP@AuNP-IgG结合酪胺信号放大（TSA）系统的黄曲霉毒素B1（AFB1）化学发光免疫分析，使用浓度为0.01 ng/mL的（A）AFB1，（B）赭曲霉毒素A（CIT），（C）伏马菌素B1（OTA）。(D) 使用（1）HRP@AuNP-IgG和（2）HRP@AuNP-IgG结合TSA系统对浓度为0、0.01和1.0 ng/mL的AFB1进行化学发光免疫分析。条形图中的结果为3次独立实验的平均值。p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.0001。

此外，我们还比较了使用HRP@AuNP-IgG和HRP@AuNP-IgG结合TSA技术时，传感器阵列上针对不同浓度AFB1的化学发光变化。如图3D所示，在使用HRP@AuNP-IgG结合TSA技术的情况下，对于CL1（1.0 ng/mL AFB1）、CL0.01（0.01 ng/mL AFB1）和CL0（无AFB1）的化学发光变化更为明显。高信号和明显的化学发光变化都表明了双重信号放大策略在竞争免疫分析中的应用前景。

3.4. 化学发光（CL）反应的动力学行为

研究了来自HRP@AuNP-IgG和链霉亲和素-HRP的辣根过氧化物酶（HRP）催化的化学发光反应的动力学行为，采用静态方法进行分析。化学发光底物能够立即触发化学发光反应。化学发光强度在1.5分钟内迅速达到最大值，并持续约1分钟。2.5分钟后，化学发光强度逐渐降低。12分钟后，化学发光强度仍能保持最大值的80%以上。因此，选择1分钟（从1.5分钟到2.5分钟）作为动态收集化学发光信号的最佳曝光时间。

3.5. 基于双重信号放大的化学发光（CL）免疫分析法的优化

在酪胺信号放大（TSA）系统中，单克隆抗体（mAb）、辣根过氧化物酶@金纳米粒子-免疫球蛋白G（HRP@AuNP-IgG）、生物素-酪胺和链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP）的浓度对双重化学发光信号放大的性能有着至关重要的影响。我们以黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白（AFB1-BSA）修饰的免疫传感器阵列和0.01 ng/mL的黄曲霉毒素B1（AFB1）作为模型进行了优化。图4A显示，随着AFB1-mAb浓度的增加，化学发光强度总体呈上升趋势。综合考虑化学发光强度和试剂用量，选择了0.85 μg/mL的AFB1-mAb。如图4B所示，随着HRP@AuNP-IgG生物偶联物浓度的增加，化学发光强度也随之增强。因此，我们直接使用制备好的HRP@AuNP-IgG进行免疫分析，无需稀释。图4C表明，当生物素-酪胺的浓度从0.04 mM增加到1 mM时，化学发光信号逐渐增强，而当生物素-酪胺的浓度从1 mM增加到5 mM时，化学发光信号则逐渐减弱，因此选择了1 mM的生物素-酪胺。随着链霉亲和素-辣根过氧化物酶浓度的增加，化学发光信号也随之增强，直至达到仪器的上限（图4D）。当链霉亲和素-辣根过氧化物酶的浓度超过1.0 × 10-4 mg/mL的链霉亲和素-辣根过氧化物酶作为最佳浓度。同样地，优化后的CIT-mAb和OTA-mAb的使用量分别选择为0.53 μg/mL和0.75 μg/mL。

图4. 浓度的优化：(A) AFB1-mAb，(B) HRP@AuNP-IgG，(C) 生物素-酪胺，和(D) 链霉亲和素-辣根过氧化物酶。对于(A) AFB1-mAb，1-4分别代表浓度为0.17、0.34、0.85和1.7 μg/mL。对于(B) HRP@AuNP-IgG，1-4分别代表浓度为0.032、0.16、0.81和4.0 nM。对于(C) 生物素-酪胺，1-4分别代表浓度为0.04、0.2、1和5 mM。对于(D) 链霉亲和素-辣根过氧化物酶，1-5分别代表浓度为8.0 × 10^-6、4.0 × 10^-5、2.0 × 10^-4、1.0 × 10^-3和5.0 × 10^-3 mg/mL。折线图中的结果为3次独立实验的平均值。

孵育时间也对化学发光免疫分析的性能产生影响。根据我们之前的工作，选择霉菌毒素标准溶液与相应单克隆抗体（mAbs）和传感器阵列的孵育时间为30分钟。在这里，我们使用黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白（AFB1-BSA）修饰的免疫传感器作为模型，对辣根过氧化物酶@金纳米粒子-免疫球蛋白G（HRP@AuNP-IgG）、生物素-酪胺和链霉亲和素-辣根过氧化物酶的孵育时间进行了优化。随着HRP@AuNP-IgG和链霉亲和素-辣根过氧化物酶孵育时间从5分钟增加到35分钟，化学发光强度逐渐增强，两者均在30分钟时趋于最大值，表明达到了饱和结合。对于生物素-酪胺，化学发光强度在5至20分钟内呈上升趋势，并在15分钟时趋于最大值。因此，选择上述三个孵育步骤的孵育时间分别为30分钟、15分钟和30分钟。

3.6. 基于双重信号放大的化学发光免疫分析法的分析性能

在最佳条件下，分析了一系列霉菌毒素的标准溶液以构建校准曲线。如图5A所示，随着霉菌毒素浓度的增加，传感位点的亮度普遍降低，这遵循了竞争性免疫分析的原则。如图5B所示，在1.0 × 10^-4至1.0 ng/mL的范围内，化学发光强度与CIT、AFB1和OTA浓度的对数值成反比，且相关系数优异（R² > 0.99）。对应于3倍标准差（3SD）信号的检测限（LOD）分别计算为CIT 0.06 pg/mL、AFB1 0.08 pg/mL和OTA 0.08 pg/mL。在一个传感器阵列上可以同时进行36次测试，耗时1.8小时，这意味着对于单个分析物的测量通量为20次测试/小时，对于3个分析物的联合检测通量为6.7个样本/小时。

图5. (A) 3种霉菌毒素的化学发光（CL）图像和(B)化学发光免疫分析的校准曲线。C1-C5分别代表CIT、AFB1和OTA的浓度为1.0 × 10-3、1.0 × 10-1和1.0 ng/mL。

化学发光免疫分析法的选择性通过分析物之间、非特异性单克隆抗体和免疫传感器阵列之间的交叉反应进行评估。以AFB1为例，将AFB1的标准溶液、CIT和OTA的混合物、以及相同浓度的3种霉菌毒素的混合物与AFB1-mAb在AFB1-BSA包被的传感器阵列上进行孵育。只有当存在AFB1时，化学发光信号才会显著下降，这表明交叉反应可忽略不计，且选择性优异。

还检查了免疫传感器阵列和辣根过氧化物酶@金纳米粒子-免疫球蛋白G（HRP@AuNP-IgG）生物偶联物的稳定性。以AFB1-BSA修饰的免疫传感器阵列为例，该阵列在4℃下储存20天后，其化学发光响应仍能保持在初始强度的97.4%。至于HRP@AuNP-IgG生物偶联物，储存82天后由其催化的化学发光发射仍能保持在新鲜制备的生物偶联物催化发射的93.5%。传感器阵列和化学发光信号标签均显示出可接受的稳定性。

总体而言，与先前报道的基于信号放大的霉菌毒素免疫分析法相比（Karczmarczyk等，2016；Wang等，2018；Zhang等，2018b；Xu等，2019；Zhang等，2019；Chen等，2020），本方法具有更低的检测限，并且与先前报道的霉菌毒素多重检测方法的通量相当（Hao等，2018；Kong等，2018；Shao等，2019）。与我们之前的工作（Jiang等，2020）相比，尽管通量略有降低，但灵敏度、稳定性和化学发光图像的美观度得到了显著提高。由于性能的提升，该传感平台在真实样品中超低浓度多种霉菌毒素的联合检测中显示出潜在的应用前景。

3.7. 肉苁蓉组织中霉菌毒素的检测

为了最大程度地减少真实样品的基质效应，选择了使用70%甲醇和5倍PBS溶液稀释的方法（S3）。通过将CIT、AFB1和OTA的标准溶液分别与肉苁蓉组织（RYR）样品混合来进行回收率实验。CIT、AFB1和OTA的回收率分别为88.85%～109.8%、98.55%～103.54%和101.22%～115.02%，这证明了所提出的化学发光（CL）免疫分析法在检测真实样品中霉菌毒素方面具有可接受的准确性。

基于优化的参数和经过全面验证的方法，将所提出的化学发光（CL）方案引入肉苁蓉组织样品中多种霉菌毒素的检测中，以评估其分析可靠性和实用性。根据化学发光结果，所有真实样品中CIT和AFB1呈阳性，而OTA呈阴性，这与参考方法的结果一致。

4.结论

通过将功能化金纳米粒子（AuNPs）、酪胺信号放大（TSA）技术和多组分免疫传感器阵列相结合，我们开发了一种基于双重信号放大的化学发光（CL）成像方法，用于痕量检测中草药（HM）中的多种霉菌毒素。该方法表现出显著的优势，如灵敏度高、线性检测范围宽、稳定性好、选择性强、操作快速简便。在检测肉苁蓉组织（RYR）真实样品时，该方法展现出优异的准确性和可重复性。从实际应用的角度来看，该方法在霉菌毒素残留联合检测方面具有广阔前景，并为饲料的安全评估和质量控制提供了新的技术支持。

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Front Immunol（IF 5.7）：IgG亚类与同种异型：从结构到效应功能

链霉亲和素磁性微球（磁珠）的使用：游离模式和预包被模式的比较

一文读懂分类界定，从分类界定文件中可以获得的信息

一文读懂《建议新增和修订的免于临床试验体外诊断试剂目录（2024年征求意见稿）》

偶联剂：碘乙酰胺（烷基化试剂、巯基封闭试剂）

偶联剂：氯乙酰胺（烷基化试剂、巯基封闭试剂）

巯基封闭试剂：NEM和MMTS