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羧基磁性微球作为基础微球，具有成本低、可操作性强、适用范围广、不需要对原料进行预处理、非特异性结合较低（某些条件下）等优点被广泛用于免疫分析。提供羧基磁性微球的主要厂家有Merck Millipore、Thermo Fisher Scientific、Dynabeads（Life Technologies）、JSR life sciences、纳微、为度、海狸等厂家（想了解具体信息，请阅读“IVD人必备技能-磁性微球信息查询”）。羧基磁性微球在包被过程中方法较多，步骤也略微复杂，可优化空间大，现将羧基磁性微球的偶联流程总结如下，希望对大家有所帮助。
1. 一步法
图1 羧基磁性微球一步法偶联工艺
一步法偶联原理：将原料（抗原、抗体、受体或配体）与EDC（含或不含NHS）同时加入准备好的羧基磁性微球中，羧基活化与原料偶联同时进行，边活化边连接。该方法操作简便，易于操作，方便放大生产，但是由于原料中也含有羧基，原料的羧基也有可能被活化，导致原料自连。因此使用一步法需要优化工艺，使偶联效率达到最大。一步法偶联的优化方向见图1，上述内容为个人观点，欢迎大家留言讨论。
2. 一步延迟法
图2 羧基磁性微球一步延迟法偶联工艺
一步延迟法偶联原理：首先将EDC和羧基磁性微球混匀，羧基活化一定时间后，加入原料进行偶联。前一段时间只存在羧基的活化，后面的偶联步骤则羧基活化和原料偶联同时进行。该方法也同一步法一样需要注意偶联步骤中原料的自连。一步延迟法偶联的优化方向见图2，上述内容为个人观点，欢迎大家留言讨论。
图3 羧基磁性微球一步延迟法变体偶联工艺
一步延迟法还存在一种变体，一步延迟法为先加EDC反应一段时间后不洗涤再加入原料，而一步延迟法变体为先加原料反应一段时间后不洗涤再加入EDC。一步延迟法变体先让原料与磁性微球靠近，然后再加入EDC让靠近的原料和磁性微球通过酰胺键进行连接。一步延迟法变体有利于原料在磁性微球上保持正确取向（原料有时间调整自己的取向）。该方法也要注意原料的自连。一步延迟法变体偶联的优化方向见图3，上述内容为个人观点，欢迎大家留言讨论。
3. 两步法
图4 羧基磁性微球两步法偶联工艺
两步法偶联原理：首先将EDC和羧基磁性微球混匀，羧基活化一定时间后，洗涤去除多余的EDC，用偶联缓冲液重悬磁性微球，然后加入原料进行偶联。前一段时间只存在羧基的活化，后面的偶联步骤只存在原料偶联，羧基活化和原料偶联彻底分开避免了原料的自连。该方法优点为偶联缓冲液和活化缓冲液可以不一样，也无需担心原料的自连。一两步法偶联的优化方向见图4，上述内容为个人观点，欢迎大家留言讨论。
选择适合的偶联方法需根据具体应用、目标原料的性质及实验要求进行综合考虑。一步法方法简单、容易放大，一步延迟法可能适合一些较为特殊的原料，两步法操作较为复杂，但是偶联批次之间的差异应该更小。每种方法都有自己的优缺点，大家在使用过程中需要结合目标原料的性质以及项目特点进行实验，通过实验结果选择合适的偶联方法。
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