点击
蓝字关注我们~
羧基磁性微球通过羧基与生物分子（抗原/抗体）的氨基反应生成酰胺键，实现将生物分子偶联到磁性微球上。但是由于生物分子的活性中心通常含有赖氨酸，也就是说活性中心通常含有游离氨基，因此使用羧基磁性微球偶联生物分子时，不可避免的会占据一部分活性中心，这可能导致生物分子亲和力下降，也可能导致生物分子的构象发生变化从而影响其生物活性。特别是对于某些对构象敏感的生物分子（如酶、受体等），这种影响可能更加显著。这时可能就需要用到氨基磁性微球，由于氨基磁珠的表面官能团为氨基，与生物分子活性中心的氨基发生偶联的可能性较低，因此更能保护生物分子的天然活性，减少在偶联过程中的活性损失。氨基磁性微球既可以和生物分子的羧基反应也可以和氨基反应，因此可选择性较强。现将氨基磁性微球的偶联工艺总结如下：
氨基磁性微球偶联工艺
1. 戊二醛法（与目标分子氨基反应）
戊二醛是用于蛋白质偶联的最常用的同型双功能试剂，特别是用于制造抗体-酶偶联物。蛋白质上的氨基可以与戊二醛反应，形成能与粒子上的氨基交联的衍生物。当使用这些双功能试剂将蛋白质偶联到微球时，一个主要的缺点是可能在两个蛋白质之间产生交联，导致不确定的复合物和沉淀。为了克服这些问题，开发了两步反应，在加入蛋白质之前去除过量的交联剂。为了克服这些问题，开发了两步法反应，在加入蛋白质之前去除过量的交联剂。醛和胺之间的希夫碱通常不够稳定，必须用合适的还原剂来还原。
基础偶联步骤：在Eppendorf管中加入100 μL氨基磁性微球(10%固体)，加入700 μL NaH2PO4 (10 mM) pH 6.8加入戊二醛至终浓度为1.25%，室温反应4小时。洗涤磁性微球以去除缓冲液中过量的戊二醛。将待偶联蛋白以1 ~ 10mg /ml的浓度溶解在0.1 M pH 9.5的碳酸钠缓冲液中。将磁性微球悬浮液与蛋白质按所需比例混合，在4℃下反应过夜（也可以室温反应一定时间，具体时间需优化）。为了减少席夫碱和任何多余的醛，加入终浓度为10mg/mL的硼氢化钠，在4℃下还原1小时（室温也行）。洗涤磁性微球，并在所需的缓冲液中重悬。
2.SMCC法（与目标分子巯基反应）
SMCC和Sulfo-SMCC是一种高性能的异型双功能交联剂，其独特的化学结构包含了N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯和马来酰亚胺两个关键基团，以及一个环己烷环作为间隔臂，环己烷环的存在可以降低马来酰亚胺基团的水解速率。
SMCC的NHS酯基团在适当的pH值条件下（通常为7~9）能够高效地与伯胺反应，形成稳定的酰胺键。这一特性使得SMCC成为连接含有氨基的生物分子（如蛋白质、多肽等）的理想选择。同时，马来酰亚胺基团在较为温和的pH值条件下（通常为6.5~7.5）能够与巯基发生特异性反应，形成牢固的硫醚键。这一反应特性使得SMCC能够用于创建马来酰亚胺活化的载体蛋白，从而方便地偶联含有巯基的生物分子，如某些酶或半抗原。
马来酰亚胺基团比NHS酯基团更稳定，在实际应用中，SMCC通常通过两步合成法来完成生物偶联过程。首先，含有氨基的蛋白质与SMCC的NHS酯基团反应，形成半偶联物。然后，这个半偶联物再与含有巯基的蛋白质反应，通过马来酰亚胺基团与巯基的特异性结合，完成整个偶联过程。这种方法不仅操作简单，而且能够保留生物分子的特异性和活性。
此外，SMCC的存储和使用也需要注意一些事项。由于SMCC对水分敏感，因此需要防潮存放，并与干燥剂一起保存。在使用时，需要从冰箱中取出并平衡至室温，以避免水分凝结对试剂的破坏。同时，选择合适的pH值条件进行反应也是确保SMCC高效发挥作用的关键。
使用SMCC或Sulfo-SMCC进行氨基磁性微球偶联的步骤如下图：
3. EDC法（与目标分子羧基反应）
EDC能够活化羧基（-COOH），使其与伯胺（-NH2）发生偶联反应，形成酰胺键。EDC在室温和低温条件下均能有效催化反应，且其活性在微酸性环境（pH值4~6）中最佳。
EDC首先与羧基发生反应，形成胺反应性O-酰基异脲中间体。该中间体可与氨基快速反应形成酰胺键，并释放异脲副产物。由于中间体在水性溶液中不稳定，因此两步偶联程序常依赖于N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）或Sulfo-NHS进行稳定。如果中间体不与胺发生反应，将导致水解、羧基的再生和N-取代尿素的释放。此外，还可能形成N-酰脲等副产物，这些副产物通常位于蛋白的疏水性区域。
使用EDC进行氨基磁性微球偶联，根据不同工艺又可以分为一步法、一步延迟法和两步法，基础步骤如下图：
使用该方法进行氨基磁性微球偶联需要注意原料自连，如果要避免该问题可以先使用磺基-N-羟基琥珀酰亚胺乙酸酯（Sulfo-NHS Acetate）进行氨基封闭，然后再进行原料活化和氨基磁性微球偶联。
4. 使用2-IT+SMCC法（与生物分子氨基反应）
2-IT（2-Iminothiolane•HCl，2-亚氨基硫烷盐酸盐）是一种硫醇化试剂，其核心结构是一个环状硫代亚氨酸酯，能够与伯胺（-NH2）反应，引入巯基基团（-SH）。在pH 7~9的条件下，该试剂能够与伯胺自发有效地反应。同时，它也能与脂肪和酚羟基反应，但速率较小。引入的巯基能够保持与原始氨基类似的电荷性质，有助于保持蛋白质的溶解度。
使用2-IT+SMCC法进行氨基磁性微球偶联的步骤如下图：
综上所述，氨基磁珠偶联工艺较多，不同项目可能需要尝试不同的工艺，通过合理的操作条件和工艺优化可以实现目标分子与氨基磁珠的高效偶联。
如果大家还尝试过其他偶联方法，欢迎在留言区交流。
END
⭐⭐⭐如果觉得上述内容对你有所帮助，请收藏并关注公众号。
历史文章：
