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叶酸受体（FRa、FRb和FRc）是富含半胱氨酸的细胞表面糖蛋白，它们与叶酸具有高亲和力，可介导叶酸的细胞摄取。尽管在大多数组织中表达水平极低，但叶酸受体，尤其是FRa，在多种癌症中高表达，以满足低叶酸条件下快速分裂细胞的叶酸需求。许多肿瘤对叶酸的依赖性已通过施用抗FRa抗体、高亲和力抗叶酸药物、叶酸基成像剂以及叶酸偶联药物和毒素进行了治疗性和诊断性利用。为了了解叶酸如何与其受体结合，我们确定了分辨率为2.8 Å的人体FRa与叶酸复合物的晶体结构。FRa具有由八个二硫键稳定的球状结构，并包含一个由所有受体亚型中保守的残基组成的深而开放的叶酸结合口袋。叶酸的蝶啶部分埋藏在受体内部，而其谷氨酸部分则暴露于溶剂中并伸出口袋入口，使其能够与药物偶联，而不会对FRa结合产生不利影响。受体与配体之间的广泛相互作用很容易解释叶酸受体的高叶酸结合亲和力，并为设计针对叶酸受体系统的更特异性药物提供了模板。
叶酸（维生素B9）是嘌呤和胸腺嘧啶（核酸的重要组成成分）合成的重要一碳供体，并且还可通过S-腺苷甲硫氨酸间接参与DNA、蛋白质和脂质的甲基化过程。因此，叶酸缺乏与多种疾病有关，包括胎儿神经管缺陷、心血管疾病和癌症。在成人组织中，叶酸主要通过还原型叶酸载体摄取，这是一种普遍表达的阴离子通道，其叶酸结合亲和力相对较低（Km为1–10 mM）。相比之下，高亲和力地摄取膳食补充剂叶酸（Kd≤1 nM）和生理上普遍存在的叶酸N5-甲基四氢叶酸（5-mTHF）则需要三种叶酸受体亚型（FRa、FRb和FRc）的功能，这些受体是富含半胱氨酸的糖蛋白，可通过内吞作用介导叶酸的摄取。在细胞内，内涵体的酸性环境会促进叶酸从受体上释放，随后叶酸通过质子偶联叶酸转运体转运至细胞质中。叶酸受体的表达主要局限于对胚胎发育（如胎盘和神经管）和叶酸重吸收（肾脏）至关重要的细胞。在三种FR亚型中，FRa表达最为广泛，在正常组织中的表达水平极低，但在许多肿瘤中的表达水平很高。因此，FRa已成为开发多种癌症治疗药物（包括抗FRa抗体、高亲和力抗叶酸药物、叶酸基成像剂以及叶酸偶联药物和毒素）的分子靶点。尽管对叶酸的结构-活性关系进行了深入研究，但由于在表达、纯化和结晶FRa以进行结构研究方面存在技术困难，FRa高亲和力识别叶酸的分子基础仍不清楚。
为了获得用于结构研究的FRa蛋白，我们在HEK293细胞中稳定表达了缺失其羧基端糖基磷脂酰肌醇锚定结构的人源FRa，将其作为分泌型IgG Fc融合蛋白（FRa–Fc）进行表达。由于从培养基中纯化的完全糖基化的融合蛋白产生的晶体衍射效果较差，因此我们采用基夫菌素（kifunensine）和内切糖苷酶H（endoglycosidase H）联合处理的方法，将复杂的碳水化合物减少为单一的N-乙酰葡糖胺（NAG）基团，从而减少抑制结晶的糖基化异质性。去糖基化的FRa–Fc与完全糖基化的蛋白具有相似的叶酸结合亲和力（约190 pM），并产生了衍射至2.8 Å的晶体。我们通过结合一个铂衍生物和六个天然硫异常数据集提供的相位信息来解析该结构。
FRa具有整体球状结构，由四条长α螺旋（α1、α2、α3、α6）、两条短α螺旋（α4、α5）、四条短β链（β1–β4）以及多个环状区域组成（见图1a、b）。其三级结构主要由16个保守的半胱氨酸残基形成的8个二硫键（C15–C43、C35–C83、C44–C87、C67–C153、C74–C124、C113–C187、C117–C167和C130–C147）高度稳定。FRa有三个预测的N-糖基化位点，分别位于N47、N139和N179。在N47和N139处观察到清晰的NAG电子密度，而在N179处观察到部分电子密度。FRa的整体折叠方式与核黄素结合蛋白（与FRa有22%的序列一致性）相似，163个Ca原子的均方根偏差为1.56 Å，但这两种蛋白质的配体口袋形状和配体结合模式差异很大。
图1 | 叶酸结合的FRa结构。a，复合物的两种视图，其中FRa呈绿色，叶酸呈灰色，N-乙酰葡糖胺（NAG）呈橙色，二硫键以黄色棒状表示。N端和C端已标记。b，FRa的带状图，叶酸和NAG以绿色棒状呈现，并与半透明的受体表面重叠。c，FRa的电荷分布表面及配体结合口袋入口的特写视图。叶酸的碳原子呈灰色，氮原子呈蓝色，氧原子呈红色。底部的颜色条显示了从-3到+3 eV的静电标度。
核心结构域由通过四个二硫键（C35–C83、C44–C87、C74–C124和C117–C167；图1a）连接在一起的α1、α2、α3和α5螺旋组成。FRa的结构中含有一个长而开放的叶酸结合口袋，该口袋由后方的α1、α2和α3形成；底部由氨基端环、β1和β2形成；左侧和顶部由α1–α2和α3–α4环形成；右侧由α4、α5、β4和β3形成（图1a、b）。叶酸以其碱性的对氨基苯甲酸部分深入负电荷口袋内部，而其谷氨酸部分的两个带负电荷的羧基则伸出至由α1–α2、β1–β2和α3–α4环形成的配体结合口袋的正电荷入口外部（图1和2b）。
图2 | FRa-叶酸相互作用的结构和生化分析。a，叶酸的σA加权2Fo-Fc电子密度图，以灰色网格显示。b，结合口袋的内部电荷分布表面使用与图1c相同的颜色编码显示，叶酸以棒状呈现。c，叶酸的结合网络，包括叶酸的头部和尾部基团的特写。结合口袋周围的残基以绿色显示，叶酸以灰色显示。氢键用虚线表示。
叶酸及其周围氨基酸残基的电子密度清晰，从而能够准确构建配体及其与结合口袋内衬相互作用的残基模型（图2a）。结合口袋的横截面揭示了结合配体与受体之间的形状和电荷互补性（图2b）。叶酸以大致垂直于由α1、α2和α3螺旋形成的平面的方向插入FRa的一个延长沟槽中，蝶呤头部基团埋藏在由α1、α2和α3形成的后方内部（图1a和2b、c）。
对氨基苯甲酸部分周围的相互作用包含氢键和疏水相互作用。首先，蝶呤环位于Y85和W171的平行侧链之间，并被Y175覆盖（图2c）。其次，亲水的蝶呤环N和O原子与受体残基形成一系列氢键。具体而言，蝶呤N1和N2原子与D81的侧链羧基形成强氢键，N3和O4原子与S174的羟基形成氢键，O4原子与R103和R106的胍基团形成两个氢键，而N5原子与H135侧链形成一个氢键（图2c和3a）。有趣的是，在抗叶酸药物甲氨蝶呤和氨蝶呤中，叶酸O4被氨基取代，导致它们对FRa的亲和力降低。氨基无法与R103和R106形成氢键，并且会与叶酸结合结构中R103的位置发生空间位阻冲突（见图3a），这为这两种化合物与FRa结合能力较差以及它们优先被还原型叶酸载体摄取提供了结构上的解释。
图3 | FRa配体结合口袋突变体的叶酸亲和力。
a，叶酸与配体结合口袋残基的相互作用图。图中，叶酸的化学结构以品红色显示，口袋残基以黑色显示，氢键以绿色虚线表示，并标明了键距（Å）。疏水相互作用以弯曲的红色线条表示。叶酸结构中的对氨苯甲酸（pteroate）和谷氨酸（glutamate）部分在图示上方标出。
b，通过[3H]-叶酸结合试验测定的野生型和突变型FRa蛋白的叶酸亲和力。条形图上方的数字表示与野生型FRa相比，亲和力降低的倍数（Kd值增加）。误差条表示标准差（n=2）。
叶酸的氨基苯甲酸酯通过与位于长配体结合口袋中部的Y60、W102和W134的疏水相互作用而稳定（图3a）。谷氨酸基团也观察到广泛的相互作用，它与W102、K136和W140的侧链形成了六个氢键，同时与H135、G137和W138的主链发生了相互作用（图2c和3a）。无论来源如何，参与配体结合的大多数残基在不同亚型的FR中都是相同的，这表明观察到的叶酸结合相互作用可能在所有三种不同的受体亚型中都是保守的。此外，生理上最常见的叶酸形式5-甲基四氢叶酸（5-mTHF）可以很容易地以与叶酸非常相似的方式对接到FRa的配体结合口袋中，这表明叶酸识别的基本机制是保守的。
为了验证结构观察结果，我们检查了关键叶酸接触残基中发生丙氨酸突变的FRa突变体的配体结合亲和力。W171A突变导致受体无法表达，表明该残基对蛋白质稳定性至关重要。所有其他突变体均表达良好，并通过放射配体结合试验纯化以确定其叶酸结合亲和力。虽然野生型FRa与[3H]-叶酸结合的Kd值为0.19 nM，但D81的替换导致亲和力降低了一个数量级以上，这与天冬氨酸羧基氧与蝶呤N1和N2的强相互作用一致，表明这种相互作用是高亲和力配体结合的关键贡献者。相比之下，Y175、K136和R106（键长≥3.15 Å）的突变影响甚微，而所有其他配体结合残基（氢键≤2.9 Å）的突变对叶酸结合的影响仅中等（亲和力降低约3.6倍），双突变体R103A/S174A和W102A/R103A的影响大致为相加。因此，这种广泛的相互作用网络使FRa-叶酸结合对单个氨基酸替换具有极高的抵抗力（图3b）。总之，结构和突变分析为蝶呤基团在受体结合口袋中锚定叶酸以及谷氨酸基团与药物和成像试剂结合的可用性提供了结构上的合理解释，同时不会不利影响受体和配体之间的相互作用。
综上所述，许多癌症高度表达FRa，因此它已成为受体介导化疗的重要靶点。然而，FR如何与叶酸和叶酸偶联药物结合一直未知。FRa-叶酸复合物结构阐明了受体如何形成一个由所有受体亚型中保守残基构成的深叶酸结合口袋，并详细揭示了叶酸如何与其受体相互作用。这些观察结果共同为设计针对叶酸受体系统的特异性药物奠定了合理的基础。
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原文信息:
Chen C, Ke J, Zhou XE, et al. Structural basis for molecular recognition of folic acid by folate receptors. Nature. 2013;500(7463):486-489. doi:10.1038/nature12327IF: 50.5 Q1
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历史文章：
Front Immunol（IF 5.7）：IgG亚类与同种异型：从结构到效应功能
