Cell Death Differ (IF 13.7): 细胞表面磷脂酰丝氨酸的暴露

文摘 2024-12-01 22:12 四川

点击蓝字/关注我们

【摘要】

磷脂酰丝氨酸（PtdSer）是一种在真核生物质膜中含量丰富的磷脂。一种称为翻转酶的ATP依赖性酶通常将磷脂酰丝氨酸保持在细胞内，但在细胞凋亡和血小板活化等生物过程中，磷脂酰丝氨酸会因搅乱酶的作用而暴露在细胞表面。一旦磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面，它就在死亡细胞上充当“吞噬我”的信号，并在活化的血小板上为凝血因子提供支架。长期以来，作用于质膜的翻转酶和搅乱酶的分子特性一直困扰着研究人员。事实上，它们的特性以及磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面的机制直到最近才被揭示。在这里，我们描述了磷脂酰丝氨酸如何在凋亡细胞和活化血小板上暴露，并讨论了磷脂酰丝氨酸在其他生物过程中的暴露情况。

事实

• ATP11A和ATP11C是P4-ATP酶家族的成员，它们在质膜上作为翻转酶发挥作用，并在细胞凋亡过程中被半胱天冬酶切割。

• 在包含10个跨膜片段的TMEM16家族蛋白中，TMEM16F和其他四个家族成员在质膜上作为钙离子（Ca²⁺）依赖的搅乱酶发挥作用。

• TMEM16F在活化的血小板上暴露磷脂酰丝氨酸（PtdSer）并释放微粒以促进血液凝固。它还参与成骨细胞中羟基磷灰石的释放，促进骨骼矿化。

• XK相关蛋白8（Xkr8）和其他两个Xkr家族蛋白在细胞凋亡过程中被切割，并促进凋亡过程中磷脂酰丝氨酸的暴露。

未解问题

• 仅在大脑和睾丸中存在的质膜翻转酶具有哪些生理作用？

• 仅在大脑和肠道中表达的TMEM16家族成员具有哪些生理作用？它们在质膜上的钙离子依赖搅乱酶活性是否在那里发挥了特定作用？

• 仅在大脑和肠道中表达的Xkr家族成员具有哪些生理作用？它们的半胱天冬酶依赖搅乱酶活性是否发挥了特定作用？

• 在活化的淋巴细胞、pyrenocytes、衰老网织红细胞、获能精子、肿瘤相关内皮细胞和包膜病毒中，磷脂酰丝氨酸的暴露是否由P4型ATP酶、TMEM16和Xkr家族调控？

• 翻转酶和搅乱酶是如何在质膜的内叶和外叶之间转运磷脂的？

磷脂酰丝氨酸在质膜中的不对称分布

在真核细胞中，质膜中的磷脂呈不对称分布。含有胺基的磷脂——磷脂酰丝氨酸（PtdSer）和磷脂酰乙醇胺（PtdEtn）仅位于质膜的细胞质侧，而磷脂酰胆碱（PtdCho）和鞘磷脂（SM）则更多地集中在质膜的细胞外侧。质膜中磷脂的分布由三种磷脂转运酶调控。翻转酶Flippase（或氨基磷脂转运酶）以ATP依赖的方式特异性地将磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺从脂双层的外侧转运到内侧。易位酶Floppase也是ATP依赖的，被认为可以将磷脂（特别是磷脂酰胆碱）从内侧转运到外侧。搅乱酶Scramblase则可以在不消耗ATP的情况下，非特异性地在两个方向上于脂双层之间转运或搅乱磷脂。

质膜翻转酶及其受钙离子和半胱天冬酶的负调控

红细胞能够以ATP依赖的方式结合氨基磷脂，这种能力被称为“翻转酶”活性。随后，在牛肾上腺髓质的嗜铬颗粒中大量检测到翻转酶，并对其进行了部分纯化。由于纯化的颗粒翻转酶具有与嗜铬颗粒中的主要ATP酶（ATP酶II）生化相似的ATP酶活性，因此提出ATP酶II即为翻转酶。对牛嗜铬翻转酶/ATP酶（ATP酶II）cDNA的分子克隆表明，ATP酶II是一种IV型P型ATP酶（P4-ATP酶），因此将ATP酶II命名为ATP8A1。P4-ATP酶仅存在于真核细胞中，是一个庞大的家族，在酵母、秀丽隐杆线虫、小鼠和人类中分别有5、6、15和14个成员。P4-ATP酶具有10个跨膜片段和2个大的细胞质环，其中含有核苷酸结合位点和ATP酶结构域。CDC50携带两个具有细胞质N端和C端的跨膜片段，可引导P4-ATP酶到达其正确的亚细胞位置。1CDC50A似乎对这些ATP酶的翻转酶和脂质转运活性至关重要。

ATP8A1及其酵母同源物Drs2p主要定位于细胞内囊泡，如颗粒体和高尔基体反面网络，而酵母中Drs2p的缺乏并不影响质膜上的磷脂酰丝氨酸翻转酶活性。因此，Drs2p以及可能的哺乳动物ATP8A1似乎是作用于细胞内囊泡的翻转酶。Dnf1p和Dnf2p是存在于质膜上的两种酵母P4-ATP酶，曾被提出作为质膜翻转酶，但它们翻转磷脂酰丝氨酸的功能存在争议。在秀丽隐杆线虫中发现的五种P4型ATP酶之一的TAT-1据报道具有质膜翻转酶活性；然而，它也被定位于细胞内，这表明它也可能在细胞内膜上作为翻转酶发挥作用。因此，质膜磷脂酰丝氨酸翻转酶的分子身份仍不确定。

图1 翻转酶的结构及其被半胱天冬酶切割的过程。图中示意性地展示了ATP11A/ATP11C和CDC50A的结构。ATP11A和ATP11C包含10个跨膜片段。位于细胞质中的ATP酶域被分为A（驱动器）、N（核苷酸结合）和P（磷酸化）三个域。携带两个跨膜区的CDC50A作为伴侣蛋白，确保ATP11A和ATP11C正确定位在质膜上。CDC50A在质膜上与ATP11A或ATP11C形成复合物，对于翻转酶活性可能是必需的。ATP11A和ATP11C分别包含2个和3个半胱天冬酶识别位点（红色），这些位点位于α-螺旋（蓝色）两侧，并在细胞凋亡过程中被切割，导致磷脂酰丝氨酸（PtdSer）暴露。线虫中的P4-ATP酶TAT-1和TAT-3在相应位置也携带推测的半胱天冬酶识别位点。保守的磷酸化位点DKT用下划线标出。

为了鉴定哺乳动物细胞中的质膜磷脂酰丝氨酸翻转酶，我们对KBM722进行了正向遗传筛选，KBM7是一种具有近单倍体核型的人类髓系细胞系。我们使用基因陷阱逆转录病毒对KBM7细胞进行了随机诱变，并通过重复细胞分选收集了不能有效结合荧光标记磷脂酰丝氨酸的细胞。我们使用下一代测序仪对分选后的细胞群中的病毒插入位点进行了测序，并确定了ATP11C和CDC50A为翻转酶候选基因（图1）。ATP11C是一种P4-ATP酶，其定位于质膜依赖于CDC50A，ATP11C的缺乏会严重降低质膜上磷脂酰丝氨酸翻转酶的活性（约80%）。另一方面，CDC50A缺乏的细胞完全丧失了将磷脂酰丝氨酸翻转至质膜外侧的能力，并持续在细胞表面暴露磷脂酰丝氨酸。这些结果确定了ATP11C是质膜磷脂酰丝氨酸翻转酶的主要成分，但也表明其他依赖于CDC50A的P4-ATP酶可能对质膜上磷脂酰丝氨酸的翻转有所贡献。事实上，通过在ATP11C缺失的细胞中建立稳定表达人类P4-ATP酶家族每个成员的转化体，我们发现不仅ATP11C，还有ATP11A和ATP8A2都定位于质膜，并能翻转磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺25（表1）。ATP11A和ATP11C在各种细胞中普遍表达，而ATP8A2仅表达于大脑和睾丸。

缩写：PM，质膜

P4-ATP酶的底物来源于Segawa等人的研究，除ATP8B3和ATP10A外。细胞的定位和组织的表达数据来源于Segawa等人、Tanaka等人、以及Panatala等人。Gong等人展示了ATP8B3在睾丸中的特异性表达。Naito等人证明了ATP10A定位于质膜，并具有转运磷脂酸肌醇（PtdCon）的能力。据称，ATP8B1、8B2和8B3在质膜上作为翻转酶，分别针对磷脂酰丝氨酸（PtdSer）、磷脂酰胆碱（PtdCho）或心磷脂发挥作用，但我们未能对此进行确认。

增加人红细胞内的钙离子浓度会抑制其结合氨基磷脂的能力，这表明钙离子可以调控质膜上的翻转酶活性。事实上，增加细胞内钙离子浓度会抑制ATP11A或ATP11C介导的质膜磷脂酰丝氨酸翻转。高浓度的钙离子也会抑制它们的磷脂酰丝氨酸依赖性ATP酶活性，这表明钙离子直接与ATP11A和ATP11C结合以抑制其活性。

细胞凋亡由半胱天冬酶介导，该酶切割＞400种细胞底物以诱导细胞死亡。细胞凋亡几乎总是伴随着磷脂酰丝氨酸（PtdSer）的外翻，这也需要半胱天冬酶的激活。在细胞凋亡过程中，翻转酶会失活，这表明翻转酶可能是半胱天冬酶的作用目标。实际上，ATP11A和ATP11C在其庞大的细胞质域中携带两个或三个进化上高度保守的半胱天冬酶3识别位点（图1）。对这些半胱天冬酶识别位点进行点突变会产生抗半胱天冬酶的翻转酶。表达这种抗半胱天冬酶翻转酶的细胞在凋亡期间无法在细胞表面暴露磷脂酰丝氨酸，也不会被巨噬细胞吞噬，这表明半胱天冬酶介导的翻转酶切割对于凋亡期间磷脂酰丝氨酸的暴露至关重要。在这方面，值得注意的是，表达不带半胱天冬酶识别位点的ATP8A2的细胞转化体在凋亡期间无法暴露磷脂酰丝氨酸，这表明ATP8A2可能在大脑和睾丸中具有特定功能。

与细胞死亡途径中的许多其他过程一样，凋亡过程中磷脂酰丝氨酸的外翻在进化上是高度保守的。秀丽隐杆线虫和果蝇中的濒死细胞会在半胱天冬酶下游暴露磷脂酰丝氨酸。在秀丽隐杆线虫中发现的五种P4-ATP酶中，TAT-1和TAT-3在与人ATP11A和11C相对应的位置具有推测的半胱天冬酶识别位点（图1）。

钙依赖性磷脂转运蛋白

当血小板被激活时，磷脂酰丝氨酸（PtdSer）会暴露在细胞表面，并为凝血因子形成支架。这一过程受细胞内钙离子的调节，这表明有一种或多种钙激活的磷脂转运蛋白参与其中。尽管磷脂转运蛋白1（PLSCR1）曾一度被报道为磷脂转运蛋白，但PLSCR1缺乏小鼠和果蝇的分子特性及表型特征，排除了其作为磷脂转运蛋白的可能性。

为了鉴定磷脂转运蛋白，我们使用小鼠细胞系Ba/F3对钙依赖性磷脂酰丝氨酸的外翻进行了表征。在0.5 mM Ca2+存在的情况下，用Ca2+离子载体A23187刺激的细胞在15分钟内将磷脂酰丝氨酸暴露于细胞表面，并发生坏死性细胞死亡。然而，在没有细胞外Ca2+的情况下用A23187处理的细胞会暂时暴露磷脂酰丝氨酸；磷脂酰丝氨酸在12小时内再次被内化。我们利用这种短暂、钙依赖性的磷脂酰丝氨酸外翻特性，建立了一个强烈暴露磷脂酰丝氨酸的Ba/F3亚系。在没有Ca2+的情况下用A23187刺激Ba/F3细胞，通过流式细胞术收集并扩增了强烈暴露磷脂酰丝氨酸的细胞群（1–5%）。这一过程重复了19次，每次离子载体浓度逐渐降低（从1 μM降至63 nM）。这一程序产生了Ba/F3-PS19，这是一个在A23187浓度（63 nM）下强烈暴露磷脂酰丝氨酸的Ba/F3亚系，而这一浓度在亲代Ba/F3细胞中不足以诱导磷脂酰丝氨酸的外翻。

为了分离磷脂转运蛋白，我们使用从Ba/F3-PS19细胞制备的2.5-6.0 kb cDNA，在基于逆转录病毒的哺乳动物表达载体中构建了一个cDNA文库。用逆转录病毒cDNA文库感染原始Ba/F3细胞，用A23187刺激并按磷脂酰丝氨酸的外翻进行分选。经过三次这一过程后，发现大量Ba/F3细胞持续暴露磷脂酰丝氨酸。这些细胞携带跨膜蛋白（TMEM）16F，具有一个点突变（第409位氨基酸的天冬氨酸突变为甘氨酸），这似乎是在对Ba/F3-P19细胞进行分选过程中自发引入的。Ba/F3和其他携带突变TMEM16F的小鼠细胞系持续暴露磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺（PtdEtn），并内化磷脂酰胆碱（PtdCho）和鞘磷脂（SM）。用细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM处理转化细胞，可阻断磷脂酰丝氨酸的外翻。这些结果表明，TMEM16F支持钙依赖性的磷脂转运。基于TMEM16F的氨基酸序列进行的拓扑分析表明，它携带八个跨膜区。然而，最近的结构分析显示，来自真菌Nectria haematococca的TMEM16F同源物携带10个跨膜区（图2）。结构和化学交联分析表明，TMEM16F以同源二聚体的形式存在。

图2 TMEM16F的结构。(a) TMEM16F的示意图。跨膜区IV和V之间的转运域（SCRD），以及由跨膜区VI–VIII中的天冬氨酸和谷氨酸组成的钙离子结合位点用红色星号表示。(b) 来自Nectria haematococca的TMEM16的三级结构。根据Brunner等人的研究。

TMEM16F是TMEM16家族蛋白（也称为anoctamins）之一，该家族有10个成员（TMEM16A-H、J和K；或Ano1-10）。2008年，三个研究小组独立报告称，广泛表达的TMEM16A作为钙激活的氯离子通道发挥作用。由于在视网膜中特异性表达的TMEM16B也作为钙依赖的氯离子通道，因此人们认为所有TMEM16家族成员都是氯离子通道。据此，一些研究小组报告称，包括TMEM16F在内的一些TMEM16家族成员作为离子通道发挥作用。野生型TMEM16F的表达使细胞对钙离子载体诱导的磷脂转运变得敏感。缺乏TMEM16F的小鼠胎儿胸腺细胞和胚胎成纤维（MEF）细胞失去了磷脂转运能力，这清楚地表明TMEM16F对于钙依赖的磷脂转运是必不可少的。另一方面，虽然TMEM16A和16B在生理条件下是强大的氯离子通道，但我们未能检测到TMEM16F的氯离子通道活性。最近，两个研究小组证实TMEM16F具有支持磷脂转运的能力，并得出结论认为TMEM16F的离子通道活性是磷脂转运的结果或在极端（不一定是生理）条件下触发的次要活性。

同时，我们在TMEM16F缺乏的细胞系中表达了10个TMEM16成员，并表明不仅TMEM16F，而且TMEM16C、16D、16G和16J也能在质膜上转运磷脂（表2）。TMEM16E、16H和16K定位于细胞内膜，也可能作为磷脂转运蛋白发挥作用。TMEM16家族在所有真核生物中都有代表。酿酒酵母和烟曲霉携带单一的TMEM16同源物，但其生化和生理功能尚不清楚。线虫携带编码TMEM16同源物的两个基因，即ANOH1和ANOH2；最近发现ANOH1参与钙依赖的磷脂酰丝氨酸外翻，我们稍后将对此进行讨论。对TMEM16A的突变分析表明，位于VI–VIII跨膜片段中的六个谷氨酸和天冬氨酸残基参与钙离子的直接结合。

缩写：PM，细胞膜

TMEM16A和16B的氯离子通道活性数据来源于Yang等人、Schroeder等人、Caputo等人以及Suzuki等人的研究。磷脂转运蛋白活性和组织分布数据来源于Suzuki等人的研究。与TMEM16相关的疾病信息，TMEM16C来源于Munchau等人和Charlesworth等人的研究，TMEM16E来源于Tsutsumi等人和Savarese等人的研究，TMEM16F来源于Suzuki等人和Castoldi等人的研究，而TMEM16K则来源于Vermeer等人和Balreira等人的研究。

这些氨基酸残基在进化上高度保守，而来自Nectria haematococca的TMEM16的结构表明，这些钙结合位点位于两个亚基之间的空腔附近。关于磷脂转运，Yu等人使用Type II-divergence程序比较了来自24种动物的TMEM16F同源物的氨基酸序列，并表明位于跨膜IV和V之间的35个氨基酸组成的结构域足以将磷脂转运活性赋予TMEM16A。该结构域被命名为转运域（SCRD）。研究TMEM16家族中是否有其他成员具有SCRD将很有趣。

激活血小板的磷脂酰丝氨酸外翻

正常生长的细胞具有高的细胞内ATP浓度，而钙离子浓度通过作为钙泵的钙离子ATP酶从细胞中去除钙离子而保持较低水平。在这些条件下，ATP11A和ATP11C主动且特异性地将磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺从脂质双分子层的外叶转移到内叶，从而在质膜中形成它们的不对称分布。当用凝血酶和胶原激活血小板时，细胞内钙离子浓度局部且短暂增加，可能在质膜附近或下方达到数百微摩尔的浓度。这种局部的钙离子增加会短暂激活TMEM16F的转运蛋白功能并失活ATP11A和11C的翻转酶（Figure 3），从而在细胞表面的有限区域内迅速暴露磷脂酰丝氨酸。当细胞恢复到静息状态时，细胞内钙离子水平降低，导致TMEM16F停止转运，ATP11A和11C的翻转酶活性恢复，从而重新建立质膜中磷脂酰丝氨酸的不对称分布。

图3 高钙浓度细胞中磷脂酰丝氨酸（PtdSer）外翻的分子机制。图中示意性地展示了由P4-ATP酶（ATP11A或ATP11C）和CDC50A组成的翻转酶以及钙离子（Ca2+）依赖性磷脂转运蛋白（TMEM16F）。在活化的血小板中，细胞内Ca2+浓度升高，激活TMEM16F以扰乱磷脂分布，同时使P4-ATP酶失活并降低其翻转活性。当Ca2+浓度恢复正常水平时，TMEM16F停止扰乱磷脂分布，而P4-ATP酶则恢复磷脂酰丝氨酸（PtdSer）和磷脂酰乙醇胺（PtdEtn）的翻转。因此，在此过程中，PtdSer只是短暂地暴露于细胞表面，并且这一过程可能依赖于细胞内ATP和Ca2+的浓度。PtdSer的持续翻转可防止暴露PtdSer的细胞被巨噬细胞吞噬。

半胱天冬酶依赖性磷脂转运蛋白

与钙离子诱导的磷脂酰丝氨酸（PtdSer）外翻不同，TMEM16F缺陷细胞的凋亡性PtdSer外翻表现正常，这证实了之前的观点，即人类淋巴细胞或小鼠血小板中存在两个独立的磷脂转运系统。为了确定负责凋亡性PtdSer外翻的磷脂转运蛋白，我们再次使用Ba/F3-PS19 cDNA文库进行了表达克隆。假设磷脂转运蛋白像通道一样应该是大型膜蛋白，我们首先筛选了一个长cDNA（42.5 kb）文库，并获得了编码911个氨基酸的TMEM16F cDNA。然而，该文库似乎并不包含导致凋亡性PtdSer外翻的磷脂转运蛋白的cDNA，因此我们转向了一个较小的cDNA（1–2.5 kb）文库。我们将文库导入Ba/F3细胞，并对其转化体进行了筛选，寻找用A23187处理后强烈暴露PtdSer的细胞。经过反复筛选，我们发现了一个持续暴露PtdSer的细胞群。这些细胞携带Xkr8的cDNA，该cDNA由401个氨基酸组成，具有6–10个跨膜区（取决于拓扑预测程序），N端和C端均位于胞质内。（图4）除了Ba/F3细胞外，在我们测试的细胞系（小鼠WR19L T细胞白血病、人类Raji淋巴瘤和PLB985白血病）中，Xkr8的转化并未导致PtdSer持续外翻，但显著增强了凋亡性PtdSer外翻。缺乏Xkr8的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和胎胸腺细胞系在凋亡时失去了磷脂转运能力（即暴露PtdSer和PtdEtn以及内化PtdCho和SM的能力），而钙离子依赖性磷脂转运则未受影响。研究还发现，由于Xkr8启动子区域发生超甲基化，人类Raji和PLB985细胞无法表达Xkr8，导致凋亡性PtdSer外翻缺陷。Xkr8的C端尾部含有一个高度保守的半胱天冬酶3识别位点，且该位点被半胱天冬酶3/7切割对于其磷脂转运蛋白活性至关重要。（图4）

图4 Xkr8的结构及其半胱天冬酶切割位点。(a) 示意性地展示了小鼠Xkr8的结构，这是一种半胱天冬酶依赖的磷脂翻转酶。图中指出了C端区域的半胱天冬酶识别位点。除了Xkr8外，Xkr4和Xkr9也在其C端尾部区域携带半胱天冬酶识别位点，并作为半胱天冬酶依赖的翻转酶发挥作用。(b) 将小鼠Xkr8（mXkr8）、秀丽隐杆线虫中的CED8和果蝇中的CG32579的氨基酸序列进行比对，以获得最大同源性。mXkr866的C端区域和CED871的N端区域的半胱天冬酶识别位点用绿色高亮显示。跨膜区域用下划线标出。

Xkr8属于Xkr家族，在人类和小鼠中分别有9个和8个成员。为了检查Xkr家族中的其他蛋白是否也作为凋亡性磷脂转运蛋白发挥作用，我们在人类PLB985细胞或Xkr8−/−小鼠胎胸腺细胞中表达了所有Xkr家族成员。结果表明，不仅Xkr8，而且Xkr4和Xkr9也支持凋亡性PtdSer外翻。（表3）与Xkr8类似，Xkr4和Xkr9的C端区域也携带一个半胱天冬酶识别位点，该位点在凋亡期间被切割以激活磷脂转运蛋白并暴露PtdSer。Xkr8在各种组织中普遍表达，在睾丸中强烈表达。Xkr4在低水平普遍表达，但在大脑和眼睛中强烈表达。Xkr9在肠道中强烈表达。Xkr4和Xkr9是否与Xkr8功能冗余，或在大脑/眼睛和肠道中发挥特定作用，仍有待研究。凋亡细胞中PtdSer的外翻不仅发生在哺乳动物中，也发生在果蝇和秀丽隐杆线虫中。因此，果蝇和线虫携带Xkr8的同源物（果蝇中为CG32579，秀丽隐杆线虫中为CED8）。（图4）CED8的N端含有一个半胱天冬酶（CED3）识别位点，且对于CED3依赖性PtdSer外翻至关重要。另一方面，果蝇的同源物（CG32579）没有明显的半胱天冬酶识别位点，尚不清楚该分子如何被激活，以及它是否参与凋亡性PtdSer外翻。

缩写：PM，指细胞膜

Xkr家族的磷脂转位活性以及Xkr4、Xkr8和Xkr9的组织分布数据来自Suzuki等人的研究。Xkr1、Xkr2和Xkr3也分别被称为XK、XPLAC和XTES，它们的组织分布由Calenda等人确定。与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白显示，Xkr2主要定位于细胞内，但也可能有部分存在于细胞膜上。与XK相关的疾病数据来自Danek等人的研究。

凋亡细胞和其他死亡细胞上的磷脂酰丝氨酸外露

尽管凋亡一度被认为是所有程序性细胞死亡的原因，但近期研究表明，细胞也可通过程序性坏死（包括坏死性凋亡或细胞焦亡）发生死亡，这些死亡方式分别由肿瘤坏死因子（TNF）和细菌感染诱导。经历凋亡、坏死性凋亡或细胞焦亡的细胞会在其表面外露磷脂酰丝氨酸（PtdSer），并以依赖于PtdSer的方式被吞噬细胞吞噬。

在凋亡的半胱天冬酶级联反应中，位于级联反应下游的半胱天冬酶3和7会裂解ATP11A和ATP11C的翻转酶并使其失活。同时，半胱天冬酶3/7会裂解Xkr8翻转酶并使其激活（图5）。这种由半胱天冬酶介导的裂解是不可逆的，从而导致PtdSer不可逆的外露。通过TMEM16F的组成性活性形式外露PtdSer的活细胞不会被巨噬细胞吞噬，但由于翻转酶活性缺失而外露PtdSer的细胞会被巨噬细胞识别和吞噬。由组成性活性翻转酶表达PtdSer的细胞携带活性翻转酶，它们似乎对巨噬细胞上的PtdSer受体亲和力较低，这可能是因为PtdSer在不断翻转。在没有翻转酶的情况下，PtdSer会持续外露且不会返回内层膜，从而增加细胞对PtdSer受体的亲和力。翻转酶完全且不可逆失活与部分且短暂失活之间的差异，可以解释为何外露PtdSer的凋亡细胞会被巨噬细胞吞噬，而激活的血小板则不会。一旦建立，需要数天才能破坏磷脂的不对称分布，因为磷脂在双层膜间的自发转运极低。在这方面，翻转酶对于凋亡期间PtdSer的快速外露至关重要。

图5 凋亡细胞中的磷脂酰丝氨酸（PtdSer）外翻现象。图中示意性地展示了Xkr8的半胱天冬酶依赖性磷脂转位酶和与CDC50A相关的翻转酶（ATP11A/ATP11C）。当细胞发生凋亡时，位于半胱天冬酶级联下游的半胱天冬酶3或7会裂解Xkr8，从而激活其转位酶活性，同时这些半胱天冬酶也会裂解并使ATP11A和ATP11C失活。这是一个不可逆的过程，并且细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸会被巨噬细胞识别并吞噬

最近，据报道一种磷脂翻转酶在秀丽隐杆线虫坏死性细胞死亡中参与磷脂酰丝氨酸（PtdSer）的外露。在秀丽隐杆线虫的触觉神经元中，机械门控钠通道的核心亚基mec-4发生显性突变会导致通道活性过高，进而引发过量的钙离子（Ca2+）内流和坏死性细胞死亡。李等人最近的研究表明，在mec-4突变的线虫中，坏死细胞通过ANOH1（一种TMEM16同源物）和CED7（一种ABCA1转运蛋白同源物）的作用使PtdSer外露。肿瘤坏死因子（TNF）诱导的坏死性凋亡和细菌诱导的细胞焦亡均由钙离子内流介导。研究TMEM16F或其他TMEM16蛋白是否在坏死性凋亡或细胞焦亡中参与PtdSer的外露将是一个有趣的课题。

磷脂翻转酶和磷脂移位酶的缺陷

缺乏CDC50A或表达持续活化TMEM16F的小鼠WR19L细胞会暴露磷脂酰丝氨酸（PtdSer），但生长正常，这表明细胞生长可能不需要质膜上磷脂的不对称分布。另一方面，ATP11C基因敲除的小鼠会出现B细胞淋巴减少、胆汁淤积、贫血、难产和肝细胞癌等症状。在ATP11C基因敲除的B细胞和红细胞中，翻转酶活性降低，暴露PtdSer的红细胞数量略有增加。然而，ATP11C−/−细胞中翻转酶活性这一微小变化是如何导致ATP11C基因敲除小鼠出现强烈表型的，目前尚不清楚。淋巴细胞或红细胞可能在特定的发育阶段仅表达ATP11C翻转酶；ATP11C基因敲除突变可能导致此阶段细胞暴露PtdSer，从而使巨噬细胞识别并吞噬这些细胞，或导致质膜蛋白的不稳定和异常组装。

斯科特综合征是一种轻度常染色体出血性疾病，由活化血小板中钙依赖性PtdSer暴露失败引起。两名患有斯科特综合征的家系患者携带TMEM16F基因的纯合无义突变或复合杂合突变。犬斯科特综合征是一种自然发生的出血性疾病，出现在德国牧羊犬中。与人类患者一样，受影响犬的活化血小板缺乏促凝活性，并携带TMEM16F基因的失活突变。杨等人和我们已建立了两种血小板缺乏TMEM16F的小鼠品系。杨等人在129/B6混合背景中建立了传统的TMEM16F基因敲除小鼠；这些小鼠的表型与人类或犬斯科特综合征显著不同。虽然活化血小板中PtdSer的暴露在很大程度上依赖于TMEM16F，但这些小鼠在没有TMEM16F的情况下也能产生组织因子诱导的凝血酶；然而，这些小鼠的尾部出血时间显著增加。杨等人认为，这一表型是由于TMEM16F阳离子通道活性缺陷所致。另一方面，我们未能检测到TMEM16F的离子通道活性，且我们在C57/B6背景中对TMEM16F基因进行血小板特异性敲除产生的小鼠表型与人类和犬斯科特综合征相匹配。即这些小鼠血小板中凝血酶/胶原诱导的PtdSer暴露完全受损，组织因子诱导的凝血酶活化也受损。然而，与人类和犬斯科特综合征相似，我们的血小板特异性TMEM16F基因敲除小鼠的尾部出血时间没有受到影响。这两种TMEM16F基因敲除小鼠品系之间差异的原因尚不清楚。

Xkr8缺陷会导致凋亡细胞PtdSer暴露丧失，死细胞不会被吞噬。同样，秀丽隐杆线虫中Xkr8同源物CED8的突变会导致死亡细胞PtdSer暴露失败，以及死细胞吞噬效率低下或延迟。掩盖PtdSer或删除识别PtdSer的分子（如MFG-E8、Tim4和TAM受体）会阻断凋亡细胞的吞噬，并诱导系统性红斑狼疮型自身免疫疾病的发展。因此，Xkr8缺陷小鼠很可能患上类似的自身免疫疾病，但这尚待证实。

展望

本文描述了一种翻转酶和两个移位酶家族（钙依赖型和半胱天冬酶依赖型），并讨论了活化血小板和凋亡细胞如何暴露磷脂酰丝氨酸（PtdSer）。PtdSer和磷脂酰乙醇胺（PtdEtn）不仅暴露于活化血小板，还暴露于半乳糖凝集素处理的中性粒细胞、免疫球蛋白E（IgE）刺激的肥大细胞、活化的CD4 T细胞、获能精子、老化红细胞、以及通过P2X7 ATP受体活化的细胞。半乳糖凝集素处理的中性粒细胞、活化的肥大细胞、活化的淋巴细胞和通过P2X7受体活化的细胞暴露PtdSer是由细胞内钙增加介导的（或至少伴随细胞内钙增加）。人们很容易推测，这些过程中PtdSer的暴露涉及具有钙依赖型移位酶活性的TMEM16F或其他TMEM16家族成员（TMEM16C、16D、16F、16G或16J）。

从网织红细胞挤压出的焰细胞（带有被质膜包围的薄层细胞质的细胞核）、乳腺中的乳脂球、外泌体、包膜病毒和从活化血小板释放的微颗粒均暴露PtdSer。焰细胞不携带线粒体，一旦与网织红细胞分离，就会迅速失去ATP，导致钙快速内流。类似的过程可能发生在乳脂球和包膜病毒中。这种ATP丧失和细胞内钙增加是否负责激活或灭活特定翻转酶或移位酶以在这些颗粒中暴露PtdSer，尚待研究。

肿瘤相关内皮细胞暴露PtdSer。一种针对PtdSer的单克隆抗体被提议作为癌症治疗方法，通过抗体或补体介导的细胞毒性杀死肿瘤相关内皮细胞。这种治疗方法似乎很有前景。最近的研究报告表明，肿瘤相关内皮细胞中的PtdSer和抗癌药物治疗后肿瘤细胞暴露的PtdSer创造了一个免疫抑制的肿瘤环境；而针对PtdSer的抗体则逆转了这一效应，产生了抗肿瘤免疫。研究本文综述中讨论的翻转酶和移位酶是否参与肿瘤相关内皮细胞上PtdSer的暴露将非常有趣。

⭐⭐⭐请注意，上述内容仅涵盖了文章的核心内容和结论部分，未包含所有技术细节和实验数据。完整内容请阅读原文。

原文信息:

Nagata S, Suzuki J, Segawa K, Fujii T. Exposure of phosphatidylserine on the cell surface. Cell Death Differ. 2016;23(6):952-961. doi:10.1038/cdd.2016.7IF: 13.7 Q1

---END---

⭐⭐⭐如果觉得上述内容对你有所帮助，请收藏并关注公众号。

历史文章：