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偶联剂2-IT（2-Iminothiolane•HCl），也被称为2-亚氨基硫烷盐酸盐或Traut's Reagent，是一种在生物化学和分子生物学领域中广泛应用的化学试剂。
一、基本信息
英文名称：Traut's Reagent，2-Iminothiolane•HCl
别名：2-亚氨基硫烷盐酸盐、特劳特试剂、Traut试剂
CAS号：4781-83-3
分子式：C4H9N2S•HCl（盐酸盐形式）
分子量：137.63（2-亚氨基硫烷盐酸盐）
外观：白色固体
溶解性：溶于DMSO（二甲基亚砜）、甲醇和水等
最大吸收峰：248 nm（在乙腈或0.1M HCl中）
消光系数（0.1M HCl）：8840M-1cm-1（±5%）
储存温度：2-8 °C
二、化学性质与反应特性
Traut's Reagent（2-亚氨基硫烷或2-IT）是一种用于硫醇化（巯基加成）的环硫咪酯化合物。2-IT与伯胺（-NH2）反应，引入巯基（-SH）基团，同时保持与原始氨基相似的电荷性质（图1）。巯基加成后，可以特异性靶向用于各种标记，交联和固定步骤中的反应。
三、应用与用途
生物分子修饰：在生物化学和分子生物学研究中，Traut's Reagent常用于生物分子的修饰，特别是用于将巯基引入蛋白质、肽或其他生物分子中。
标记与交联：引入的巯基可用于各种标记、交联和固定步骤中的反应特定靶向。例如，它可以用于制备二硫化物或硫醚，以及用于RNA-蛋白质的交联。
蛋白质组学研究：在蛋白质组学研究中，该试剂可用于肽标记和生物分子相互作用研究。
四、使用
反应特异性：Traut's 试剂在 pH7~9 条件下，能有效自发地与伯胺反应。虽然它也能与脂肪和酚羟基反应，特别是在高 pH 下，但这些反应的速率远低于与氨基的反应，速率慢了近100倍。因此，在胺存在且反应时间不长于过夜的情况下，与脂肪和酚羟基的反应通常可以忽略不计。
反应缓冲液：多种缓冲液可用于Traut试剂的硫醇化反应，其中磷酸盐缓冲液（PBS）或0.1M硼酸盐缓冲液（pH 8）最适合蛋白质或肽的修饰。对于核糖体蛋白质的修饰，常用50mM三乙醇胺·HCl、1mM MgCl2、50mM KCl（pH 8.05）的缓冲液。多糖的修饰（在无胺条件下）则最好在pH 10的20mM硼砂缓冲液中进行。尽管其他不含伯胺的缓冲液也能进行修饰，但上述缓冲液更为常用和有效。
水解速率和反应化学计量学：（1）Traut's试剂在酸性或中性且不含伯氨基的缓冲液中非常稳定，即使在碱性条件下，其水解速度也远慢于与伯胺的反应速率。例如，在pH 8的50 mM三乙醇胺缓冲液中，试剂水解的半衰期为1小时，而与20 mM甘氨酸（伯胺）反应的半衰期仅为5分钟。（2）由于水解速度相对较慢，使用Traut试剂进行硫醇化时，不需要像其他修饰试剂那样使用大量的摩尔过量。通常，超过胺2倍的摩尔过量的Traut试剂就足以确保有效修饰。对于大蛋白质，如IgG，可以通过调整Traut试剂的摩尔比来控制硫醇化水平。例如，10倍摩尔过量的试剂可以确保IgG分子被至少3~7个巯基修饰，而50倍摩尔过量的试剂虽然可以修饰几乎所有伯胺，但可能损害抗体功能。（3）在pH 8时，含有伯胺的Tris和氯化铵缓冲液与Traut试剂的反应速度较慢，不会特异性消耗试剂。蛋白质的伯胺与Traut试剂的硫醇化反应通常在1小时内完成，且甘氨酸比Tris更有效的作为淬灭剂。
用 Traut 试剂将蛋白质硫醇化的方法：（1）将蛋白质溶解在pH 8.0的非胺缓冲液中，并在该缓冲液中加入2~5 mM的EDTA。EDTA的作用是螯合溶液中的二价金属离子，这样做可以防止蛋白质中的巯基（硫醇基团）被氧化，从而避免形成不利的二硫键。这样的处理有助于保持蛋白质的稳定性和活性。（2）根据蛋白质的大小、浓度以及期望的硫醇化水平，向蛋白质溶液中加入2到20倍摩尔过量的Traut试剂。首先，将Traut试剂溶解于水或适当的缓冲液中，制备成终浓度为2 mg/ml（即14 mM）的储备溶液。然后，根据需要的摩尔过量比例，从储备溶液中取适量加入到蛋白质溶液中。例如，若要使用10倍摩尔过量的Traut试剂来修饰浓度为10 mg/ml的IgG，可以这样计算：每毫克IgG分子中含有的赖氨酸残基数量（即伯胺基团）是已知的，但为简化计算，我们可以假设一个大致的摩尔比例。由于IgG的分子量约为150 kDa，且含有多个赖氨酸残基，我们可以估算出每毫升10 mg/ml的IgG溶液中含有一定摩尔数的伯胺基团。为了修饰这些伯胺基团，我们需要加入10倍摩尔过量的Traut试剂。具体操作为：每毫升10 mg/ml的IgG溶液中加入46微升14 mM的Traut试剂储备溶液。这样，加入的Traut试剂摩尔数就是IgG中伯胺基团摩尔数的10倍，从而确保有效的硫醇化修饰。请注意，这里的计算是基于简化的假设和估算，实际操作中可能需要根据具体的IgG分子结构和硫醇化需求进行调整。（3）室温下孵育1小时。然后用含有2~5mM EDTA的缓冲液平衡脱盐柱，分离硫醇化的蛋白与过量的Traut试剂。可以使用Ellman试剂测试巯基含量。
五、注意事项
操作安全：虽然该试剂在科研中广泛应用，但具有刺激性气味，操作时应佩戴防护手套和护目镜，避免与皮肤和眼睛直接接触。同时，应在通风橱中进行操作，避免吸入刺激性气体。
纯度与质检：使用前应确认试剂的纯度和批次信息。不同批次的试剂可能因生产工艺的不同而呈现不同的颜色，但这通常不会影响其化学性质和使用效果。
综上所述，Traut's Reagent（2-Iminothiolane•HCl）是一种功能强大的偶联剂，在生物化学和分子生物学研究中具有广泛的应用前景。通过其独特的化学性质和应用特点，它为科学家们提供了一种简单、高效且特异性的方法来修饰和标记生物分子。
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