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巯基封闭试剂有很多，前面的文章已经介绍了碘乙酰胺（IAM，iodoacetamide）、氯乙酰氨（ClAM，chloroacetamide）。本文主要介绍N-乙基马来酰亚胺（NEM）和甲基甲烷硫代磺酸酯（MMTS）。
1. N-乙基马来酰亚胺（NEM）
N-乙基马来酰亚胺（NEM）是一种烷基化试剂，能与巯基反应形成稳定的硫醚键。在pH值为6.5-7.5的条件下，马来酰亚胺的反应对巯基具有特异性。当pH值大于7.5时，它会与氨基发生反应。马来酰亚胺基团通过巯基阴离子对双键中一个碳原子的亲核攻击与巯基反应。当足够的巯基被封闭后，可以通过监测300nm处吸光度的降低来判断反应进程，因为此时双键转变为了单键。由此形成的硫醚基团具有不可逆性，意味着一旦巯基被NEM封闭，就无法再被其他试剂打开或恢复。NEM是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，能够抑制某些酶的活性，如磷酸盐转运酶和脯氨酰内肽酶等。此外，NEM还具有去泛素化酶抑制剂的活性。
1.1 基本信息
名称：N-乙基马来酰亚胺（N-Ethylmaleimide，NEM）
分子式： C6H7NO2
分子量：125.13
CAS号：128-53-0
外观：白色至类白色结晶性粉末
沸点：210°C
闪点：73°C
溶解性：在甲醇中溶解度较高，20°C时可达1M，且溶液清澈无色；在水中的溶解度较低，20°C时约为1g/L
储存条件：建议储存在2~8°C的环境中，以保持其稳定性和活性
1.2 封闭蛋白质巯基的一般步骤
（1）先将N-乙基马来酰亚胺（NEM）平衡至室温，以防止瓶内出现冷凝水，随后发生水解并丧失功能。
（2）将待封闭的蛋白质溶解于适当的缓冲液中，浓度为1-10mg/mL。
（3）用纯化水制备100-200mmol/L的NEM溶液。向待封闭巯基的蛋白中加入至少10倍摩尔过量的NEM。或者，向蛋白质中加入等质量的NEM。
注意：NEM溶液应在使用前立即制备，以防止马来酰亚胺基团发生水解。缓冲液的pH值需要在6.5~7.5范围内，当pH＞7.5时，马来酰亚胺基团可能与伯胺发生反应，并且自身的水解反应也会加快。
（4）在室温下反应2小时。
（5）通过透析或脱盐处理封闭的蛋白质，去除过量的NEM。
注意：反应后，可使用Ellman试剂来测定剩余巯基的水平。
2.甲基甲烷硫代磺酸酯（MMTS）
MMTS是一种能与巯基反应的化合物，可用于可逆性地磺酰化含硫醇的分子。MMTS与还原态的巯基（-SH）反应，会将其修饰为二硫甲烷（-S-S-CH3）。随后使用还原剂如二硫苏糖醇（DTT）、2-巯基乙醇（2-ME）或三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）进行处理，会断裂二硫键，从而恢复原始的巯基。若需不可逆的封闭巯基，请使用碘乙酰胺、氯乙酰胺或N-乙基马来酰亚胺。MMTS常用于研究涉及硫醇依赖性酶的生化途径。
2.1 基本信息
名称：甲基甲烷硫代磺酸酯（Methyl methanethiosulfonate，MMTS）
分子式：C2H6O2S2
分子量：126.2
CAS号：2949-92-0
外观：无色至淡绿色液体（具体颜色可能因纯度、存储条件等因素而有所差异）
沸点：69-71°C（0.4 mmHg）
密度：1.337 g/mL at 25°C
闪点：87°C（或190°F，具体数值可能因测试方法而异）
储存条件：通常建议在2-8°C下储存，以保持其稳定性和活性。
2.2 使用注意事项
MMTS（甲基甲硫基磺酸酯）的反应必须在不含硫醇类试剂的缓冲液中进行，但预定要修饰的硫醇类试剂除外。可用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液（PBS）和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH值范围在7-8之间。该液体试剂（纯度约为99%）为10.6M溶液。在硫醇依赖性生化途径的测定中，MMTS的最终浓度通常为1-1000µM，相对于硫醇靶标，存在数倍的摩尔过量，通常足以产生可测量的效果。
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