Nature(IF 50.5): 确定Tim4为磷脂酰丝氨酸受体

在程序性细胞死亡中，大量细胞发生凋亡，并被巨噬细胞吞噬，以避免凋亡细胞释放有害物质。在决定性红系前体细胞生成过程中，红系前体细胞会排出细胞核，这些细胞核随后被巨噬细胞吞噬。磷脂酰丝氨酸暴露在凋亡细胞的表面以及红系前体细胞排出的细胞核表面；它作为吞噬细胞的“吞噬我”信号。参与细胞间信号传导的外泌体表面也表达磷脂酰丝氨酸。在这里，我们建立了针对小鼠腹腔巨噬细胞的仓鼠单克隆抗体库，并发现了一种强烈抑制磷脂酰丝氨酸依赖性凋亡细胞吞噬的抗体。通过表达克隆技术，我们确定了该抗体识别的抗原是一种称为Tim4（T细胞免疫球蛋白和粘蛋白域分子；也称为Timd4）的Ⅰ型跨膜蛋白。Tim4在小鼠包括脾脏、淋巴结和胎肝在内的多种组织的Mac11细胞中表达。Tim4通过其免疫球蛋白域识别磷脂酰丝氨酸，与凋亡细胞结合。成纤维细胞中Tim4的表达增强了其吞噬凋亡细胞的能力。当向小鼠注射抗Tim4单克隆抗体时，胸腺巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用显著受阻，并且小鼠产生了自身抗体。在Tim家族的其他成员中，Tim1特异性结合磷脂酰丝氨酸，而Tim2和Tim3则不结合。表达Tim1或Tim4的Ba/F3 B细胞通过磷脂酰丝氨酸与外泌体结合，外泌体刺激Tim1和Tim4之间的相互作用。这些结果表明，Tim4和Tim1是凋亡细胞吞噬过程中的磷脂酰丝氨酸受体，也可能参与外泌体介导的细胞间信号传导。

Caspase活化的脱氧核糖核酸酶（CAD）缺陷型细胞不会发生凋亡性DNA断裂，但其DNA在被吞噬细胞吞噬后会被降解。我们利用这一知识来检测凋亡细胞的吞噬情况，并鉴定出MFG-E8（乳脂球表皮生长因子8）能刺激凋亡细胞的吞噬。MFG-E8在硫代乙醇酸诱导的腹膜巨噬细胞、淋巴结和脾脏的指状小体巨噬细胞、朗格汉斯细胞和乳腺上皮细胞中表达。Hu等人报道，未成熟的腹膜巨噬细胞以磷脂酰丝氨酸（PS）依赖的方式吞噬凋亡细胞。我们用CAD2/2胸腺细胞作为猎物（图1a）的检测系统证实了这一点。腹膜巨噬细胞能有效吞噬凋亡细胞，这一过程被MFG-E8的D89E突变体抑制，该突变体能掩盖PS。然而，腹膜巨噬细胞表达的MFG-E8很少，且这种MFG-E8缺乏并不影响这些巨噬细胞吞噬凋亡细胞的能力。为了确定参与吞噬过程的分子，我们用小鼠腹膜细胞免疫亚美尼亚仓鼠，并制备了杂交瘤。在1200个杂交瘤中，有一种单克隆抗体（Kat5-18）能以剂量依赖的方式抑制腹膜巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬（图1a）。大多数Mac11腹膜细胞都能被Kat5-18染色（图1b），这表明腹膜巨噬细胞表达了其抗原。

图1 | 腹膜巨噬细胞中的Tim4。a，使用小鼠腹膜细胞进行吞噬实验，使用D89E10或Kat5-18进行处理，然后进行TUNEL染色，通过流式细胞术进行分析，并确定TUNEL阳性巨噬细胞的百分比。图中所示为两次实验的平均值。b，腹膜巨噬细胞与生物素标记的Kat5-18孵育，随后加入FITC标记的链霉亲和素和APC标记的抗Mac1抗体。c，通过流式细胞术使用Kat5-18分析亲本和表达Tim4的Ba/F3细胞。d，通过实时PCR测定常驻或硫代乙醇酸钠诱导的腹膜巨噬细胞以及骨髓来源的不成熟树突状细胞中Tim4和MFG-E8的mRNA水平。e，通过实时PCR测定小鼠组织中Tim4的mRNA水平。f，通过实时PCR测定来自淋巴结、脾脏和胎肝的Mac11和Mac12细胞中Tim4的mRNA水平。

为了鉴定Kat5-18的抗原，我们使用了逆转录病毒介导的表达克隆技术。我们从小鼠腹膜细胞中构建了信使RNA互补DNA文库，将其转化为逆转录病毒，并用于感染小鼠Ba/F3细胞。培养2天后，我们使用细胞分选仪对被Kat5-18标记的转化体（少于0.1%）进行分选，然后在培养中扩增，并再次分选。这个分选和扩增的循环重复了三次，直到大多数细胞都被Kat5-18染色。被分选的Kat5-18⁺细胞携带2-3个不同的整合互补DNA，在两个独立实验中都发现了Tim4互补DNA。当将Tim4互补DNA导入Ba/F3时，转化体被Kat5-18强烈染色（图1c），证实Tim4是Kat5-18识别的抗原。实时PCR显示，Tim4信使RNA在常驻腹膜细胞中表达，但在硫代乙醇酸钠诱导的腹膜细胞中不表达（图1d），这与MFG-E8的表达情况截然不同，MFG-E8在硫代乙醇酸钠诱导的腹膜细胞中表达，但在常驻腹膜细胞中表达较弱。在骨髓来源的不成熟树突状细胞中也观察到了类似的情况，这些细胞高表达MFG-E8，但不表达Tim4。其他表达Tim4的主要组织包括脾脏、胸腺、淋巴结和唾液腺（图1e）。当使用MACS（磁激活细胞分选）将脾脏、淋巴结和胎肝中的细胞分选为Mac11和Mac12细胞时，仅在Mac11细胞中发现了Tim4信使RNA（图1f）。流式细胞术显示，淋巴结中约20%的Mac11细胞表达Tim4。

DNase II在吞噬细胞吞噬凋亡细胞后，在溶酶体中降解这些细胞的DNA16。为了研究Tim4在吞噬凋亡细胞中的作用，我们建立了表达Tim4的成纤维细胞系，该细胞系使用表达DNase II的NIH3T3细胞（NIH3T3/DNase II/Tim4）。亲本NIH3T3/DNase II吞噬凋亡细胞的能力较弱：当与凋亡的CAD2/2胸腺细胞共同孵育120分钟时，只有20%的细胞吞噬了凋亡细胞（图2a）。另一方面，在60分钟内，超过50%的NIH3T3/DNase II/Tim4吞噬了凋亡细胞。通过显微观察证实了Tim4的这种作用。也就是说，当凋亡细胞与NIH3T3/DNase II共同培养时，很少看到凋亡细胞附着在NIH3T3/DNase II上（图2b）。相比之下，许多凋亡细胞与NIH3T3/DNase II/Tim4相关联，并且许多都是TUNEL阳性，表明这些细胞已被吞噬。NIH3T3/DNase II/Tim4吞噬凋亡细胞，但不吞噬健康细胞，并且这种吞噬作用被Kat5-18以剂量依赖性方式抑制（图2c），证实了Tim4赋予了NIH3T3/DNase II吞噬凋亡细胞的能力。为了在体内确认Tim4的功能，给CAD2/2小鼠注射Kat5-18，并用地塞米松处理以诱导胸腺细胞凋亡。如图2d所示，在接受对照IgG的小鼠胸腺中，32.3%的F4/80⁺巨噬细胞携带超过15个TUNEL阳性凋亡细胞。在接受Kat5-18的小鼠胸腺中，携带超过15个凋亡细胞的巨噬细胞百分比降低至约12.6%。凋亡细胞吞噬效率低下通常会导致自身免疫性疾病。事实上，在接受Kat5-18的小鼠血清中，5周内就出现了自身抗体（抗心磷脂抗体和抗双链DNA抗体）（图2e）。两只小鼠对Kat5-18反应强烈，两只反应较弱，但注射正常IgG或磷酸盐缓冲盐水（PBS）从未引起自身抗体的产生。当中断注射Kat5-18时，血清抗心磷脂抗体水平降低，证实了这种增加是由Kat5-18引起的。

图2 | Tim4介导的凋亡细胞吞噬作用。a，将携带DNase II的NIH3T3细胞（实心方块，空心方块）和同时携带DNase II和Tim4的NIH3T3细胞（实心圆圈，空心圆圈）与3.0×10⁵（空心方块，空心圆圈）凋亡CAD2/2胸腺细胞共同孵育指定时间。通过流式细胞术测定TUNEL阳性巨噬细胞的百分比。图中所示为三次实验的平均值；误差条表示±标准误（s.e.）。b，将用于60分钟吞噬作用的携带DNase II的NIH3T3细胞和同时携带DNase II和Tim4的NIH3T3细胞进行TUNEL染色，并通过显微镜观察。箭头指示TUNEL阳性细胞。c，在Kat5-18存在的情况下，将携带DNase II的NIH3T3细胞或同时携带DNase II和Tim4的NIH3T3细胞与健康胸腺细胞或凋亡胸腺细胞共同孵育，然后进行TUNEL染色。通过流式细胞术测定TUNEL阳性巨噬细胞的百分比。图中所示为三次实验的平均值；误差条表示±标准误（s.e.）。d，向CAD2/2小鼠注射正常仓鼠抗体或Kat5-18，然后给予地塞米松处理。上方图片显示胸腺的TUNEL（绿色）和F4/80（红色）染色。下方图片显示对随机选择的50个巨噬细胞中的TUNEL阳性细胞进行计数。实验重复三次，并绘制携带超过15个凋亡细胞的巨噬细胞百分比图（右侧）。使用Mann-Whitney U检验分析差异，并显示P值。e，向小鼠每两周注射一次正常仓鼠IgG、Kat5-18或磷酸盐缓冲液（PBS），持续5周。在2周、5周和10周时测定血清中的抗心磷脂抗体和抗双链DNA抗体浓度。P值的确定方法同上。A492表示492纳米处的吸光度。

小鼠Tim4是一种I型膜蛋白，由一个信号序列以及细胞外区域、跨膜区域和胞质区域组成（图3a）。为了研究Tim4如何促进凋亡细胞的吞噬作用，将Tim4的细胞外区域与人免疫球蛋白G（IgG）的Fc区域融合（Tim4-Fc）。纯化的Tim4-Fc在还原条件下的SDS-PAGE中显示82 kDa的条带，而在非还原条件下显示170 kDa的条带，这表明Tim4-Fc以二聚体的形式存在。当表达Fas的Ba/F3细胞经Fas配体处理后，发生凋亡并与膜联蛋白V（annexin V）结合（图3b），膜联蛋白V可与凋亡细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸（PS）结合。这些细胞也与Tim4-Fc结合，且结合的时间过程与它们与膜联蛋白V的结合相似。当用各种磷脂点样的硝酸纤维素滤膜与Tim4-Fc孵育时，Tim4-Fc与PS结合，但不与磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇或磷脂酰乙醇胺结合（图3c）。用涂有磷脂的微孔板测定Tim4-Fc对PS的亲和力，发现其与MFG-E8的亲和力相当（Kd<2 nM）（图3d）。这些结果表明，Tim4识别凋亡细胞表面暴露的PS作为吞噬信号。为了支持这一观点，MFG-E8突变体D89E以剂量依赖的方式抑制了NIH3T3/DNase II/Tim4细胞对凋亡细胞的吞噬。

图3 | 与磷脂酰丝氨酸的结合。a，Tim4的结构，显示了信号序列（S）、IgV样结构域（IgV）、粘蛋白样结构域（Mucin）、跨膜区（TM）和胞质区（Cyt）。a.a.，氨基酸。Tim4-Fc融合了Tim4的胞外区和人IgG的Fc区。b，用Fas配体处理指定时间的Ba/F3-Fas细胞，用膜联蛋白V或Tim4-Fc染色。c，将含有磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰乙醇胺（PE）或磷脂酰丝氨酸（PS）的滤膜与Tim4-Fc孵育，随后加入抗IgG抗体。d，用指定的磷脂包被的微量滴定板与Tim4-Fc孵育，随后加入抗IgG抗体。实验重复三次。e，使用Tim1-Fc、Tim2-Fc和Tim3-Fc重复c中的脂质覆盖实验。f，Tim1、Tim2和Tim4的胞外区及其与人IgG融合的杂交体的结构。g，用PS包被的微量滴定板与不同浓度的Tim1-Fc、Tim2-Fc、Tim4-Fc或其杂交体孵育。

Tim家族在人类中有三个成员（TIM1、3和4），在小鼠中有八个成员（Tim1–8）。为了研究其他Tim家族成员是否能识别PS，制备了小鼠Tim1、Tim2和Tim3的Fc融合蛋白。Tim1-Fc、Tim2-Fc和Tim3-Fc均以二聚体的形式存在。脂质覆盖实验表明，Tim1-Fc特异性地与PS结合，而Tim2-Fc和Tim3-Fc则不与PS结合（图3e）。因此，当在NIH3T3/DNase II细胞中表达全长Tim1时，其会增强对凋亡细胞的吞噬作用，而Tim2和Tim3则无此作用。Tim家族成员的细胞外区域由两个结构域组成（IgG V样链（IgV）结构域和粘蛋白结构域）。为了研究Tim1和Tim4的哪个结构域负责与PS结合，将Tim1和Tim2的IgV结构域和粘蛋白结构域进行互换，并将Tim4和Tim2的IgV结构域和粘蛋白结构域进行互换，然后与Fc区域融合（图3f）。如图3g所示，携带Tim1或Tim4的IgV结构域的嵌合体分子紧密地与PS结合，而携带Tim1或Tim4的粘蛋白结构域的嵌合体分子则无结合作用。

多种哺乳动物细胞会产生外泌体，其表面会暴露出磷脂酰丝氨酸（PS）。Tim1和Tim4能够与PS结合的能力表明，外泌体可能会与表达Tim1或Tim4的细胞结合。为了验证这种可能性，我们建立了表达Tim1或Tim4的Ba/F3细胞系（Ba/F3-Tim1或Ba/F3-Tim4）。正在生长的Ba/F3-Tim1或Ba/F3-Tim4细胞（而非亲本Ba/F3细胞）会与膜联蛋白V结合（图4a）。随后，用生物素标记的膜联蛋白V处理Ba/F3-Tim1和Ba/F3-Tim4细胞，再用金标记的链霉亲和素染色。通过电子显微镜观察发现，Ba/F3-Tim1或Ba/F3-Tim4细胞与外泌体样囊泡相关，并且在这些外泌体的外小叶上发现了几个金颗粒（图4b）。在Ba/F3亲本细胞中未观察到此类囊泡。Meyers等人报告称，Tim4是Th2细胞中表达的Tim1的配体。因此，Tim1-Fc与Ba/F3-Tim4的结合能力很强（图4c）。此外，Tim1-Fc还会与Ba/F3-Tim1结合，Tim4-Fc会与Ba/F3-Tim4结合。Tim4和Tim1能够与PS结合，这表明Tim1和Tim4之间的这种同嗜性和异嗜性相互作用可以被外泌体刺激。为了支持这一观点，膜联蛋白V会抑制Tim4-Fc与Ba/F3-Tim4的结合（图4d）。为了直接确认外泌体对Tim1和Tim4之间结合的影响，将微球涂覆Tim4-Fc，并与Tim1-Fc进行结合测定。如图4e所示，仅有极少量Tim1-Fc与涂覆Tim4-Fc的珠子结合，而来自Ba/F3细胞的外泌体会以剂量依赖的方式刺激Tim1-Fc与珠子的结合。暴露于质膜外小叶的磷脂酰丝氨酸常被用作吞噬细胞吞噬凋亡细胞的识别信号。Fadok等人报告称，磷脂酰丝氨酸受体（PSR）是一种普遍表达的II型膜蛋白，会与凋亡细胞上的PS结合并介导其吞噬，而使用PSR2/2小鼠进行的初步实验也支持了这一观点。然而，Bose等人对PSR2/2小鼠的仔细分析表明，PSR并不参与凋亡细胞的吞噬，也不太可能作为PS的受体发挥作用。在本文中，我们证明了在各种组织中巨噬细胞表达的Tim4通过识别PS来介导凋亡细胞的吞噬，这表明Tim4是凋亡细胞吞噬的磷脂酰丝氨酸受体。Tim1也增强了PS依赖的凋亡细胞吞噬作用。Tim1在缺血后的肾小管细胞中表达，这表明它可能在清除受损和死亡细胞以帮助恢复肾脏形态完整性方面发挥作用。研究其他分子是否作为磷脂酰丝氨酸受体将非常有趣。

图4 | Tim1和Tim4通过外泌体相互关联。a，用PE标记的膜联蛋白V孵育Ba/F3-Tim4细胞，并通过流式细胞术进行分析。Ba/F3细胞的染色情况用红色表示。b，Ba/F3、Ba/F3-Tim1或Ba/F3-Tim4细胞与生物素标记的膜联蛋白V孵育，并用链霉亲和素-胶体金染色后的电子显微镜图像。箭头指示外泌体样囊泡上的金颗粒。比例尺，0.3毫米。c，Ba/F3-Tim4或Ba/F3-Tim1细胞与Tim1-Fc或Tim4-Fc孵育，用FITC标记的抗IgG抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。Ba/F3细胞的染色情况用红色表示。d，Ba/F3-Tim4细胞在无膜联蛋白V或有膜联蛋白V存在的情况下与Tim4-Fc孵育，并用FITC标记的抗IgG抗体染色。e，用Tim4-Fc包被的乳胶珠在无（绿色）或10倍（蓝色）或50倍（棕色）浓缩的外泌体存在的情况下与Tim1-Fc孵育，用PE标记的抗Tim1抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。无Tim1-Fc的染色情况用红色虚线表示。

据报道，一些非凋亡的T细胞或B细胞以及巨噬细胞能够结合膜联蛋白V。在本文中，我们证明了表达Tim1或Tim4的细胞能够与携带暴露PS的外泌体结合。活化的Th2细胞和B细胞表达Tim1，而常驻巨噬细胞表达Tim4，这表明那些非凋亡的膜联蛋白V结合细胞是表达Tim1或Tim4的细胞。外泌体由各种细胞分泌，并作为细胞间信号传递装置发挥作用。Tim1和Tim4可能通过增强外泌体的摄取来介导这种信号传递。表达Tim1或Tim4的细胞倾向于聚集（M.M.和S.N.，未发表的结果）。有研究表明，活化T细胞上的PS在免疫突触处的细胞间接触中发挥作用。因此，Tim1和Tim4也可能通过外泌体上的PS参与细胞间相互作用。最后，人和鼠的Tim家族基因位于一个与多种自身免疫性疾病（如哮喘、过敏和特应性）相关的遗传区间内。将Tim1和Tim4确定为PS受体可能有助于理解这些自身免疫性疾病。

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