Nature communications（IF：14.7）：从阿尔茨海默病患者脑组织纯化的Aβ淀粉样纤维的冷冻电镜结构和多态性

【前言】阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，其特征是Aβ淀粉样纤维沉积以及由tau蛋白衍生的神经纤维缠结。多项观察表明，Aβ肽对触发疾病发作至关重要。Aβ前体蛋白（APP）基因的异常扩增以及APP基因或参与APP加工的酶基因的突变都会导致AD。该肽及其相关的纤维会形成实质斑块和血管淀粉样沉积，这是脑淀粉样血管病（CAA）的基础。Aβ沉积物可包含该肽的不同主要结构变体。特别是40个和42个残基的肽变体Aβ(1–40)和Aβ(1–42)得到了深入研究。虽然Aβ(1–42)肽被认为通过形成有毒纤维中间体而具有致病性，但Aβ(1–40)形成的纤维沉积物会损伤脑血管壁。

目前关于Aβ肽的大部分知识来源于对化学合成或体外重组表达的Aβ肽形成的Aβ纤维和其他聚集体的分析。这些试管衍生的Aβ聚集体通常富含β-片层。纤维具有交叉β结构和对刚果红的亲和力，这与从患者组织中纯化的淀粉样纤维相似。体外形成的Aβ纤维具有高度多态性，在不同肽变体形成的不同纤维形态或不同纤维形成条件下，已发现一系列不同的肽构象。然而，迄今为止，尚不清楚这些结构中的哪一种（或是否有任何一种）能正确反映Aβ肽在脑内的致病结构。

为了阐明这一问题，我们从阿尔茨海默病大脑的血管（脑膜）中纯化了Aβ淀粉样纤维，并分析了其结构特征。我们使用冷冻电子显微镜（cryo-EM）表明，来自脑组织的Aβ纤维具有多态性，但在肽折叠和原纤维（PF）组装方面具有保守的结构特征。最重要的是，观察到的结构与已知的体外形成的Aβ纤维结构存在显著差异。

【结果】

从阿尔茨海默病（AD）脑组织中分离Aβ淀粉样纤维

从三名阿尔茨海默病（AD）患者的脑膜中分离出Aβ淀粉样纤维，这里分别称为AD1至AD3。这些患者的去世年龄为70至84岁，并表现出Braak病理阶段VI-VIB。所有三名患者的脑组织均显示出类似的组织病理学病变，包括大脑皮层中存在大量神经元斑块和神经纤维缠结，以及软脑膜和皮质浅层血管中的严重淀粉样血管病。温和的纯化程序避免了剧烈的化学或物理条件，并且之前已有描述表明该程序能够维持提取纤维的线性结构。对负染色样本进行透射电子显微镜（TEM）分析，揭示了我们样本中纤维的伸长形态。变性凝胶电泳和考马斯亮蓝染色显示了纤维蛋白的纯度，其表观分子质量为4 kDa。使用6E10抗Aβ抗体进行蛋白质印迹分析，证实了Aβ的存在。质谱分析产生了与Aβ（1–40）、Aβ（1–38）、Aβ（2–40）、Aβ（1–37）、Aβ（1–36）和Aβ（1–39）相对应的强烈质荷比（m/z）峰，这表明氨基酸侧链的翻译后修饰较少，而链长变异是最常见的修饰。这些纤维提取物中的Aβ（1–42）水平较低，这与脑膜样本的文献数据一致。所研究的三名患者的Aβ修饰模式相似，与其相似的神经病理学表现相对应。

脑源性Aβ淀粉样纤维呈右手螺旋扭曲

脑源性纤维具有清晰的交叉结构的扭曲形态，让人联想到体外形成的Aβ纤维（图1a）。通过铂侧影技术以及透射电子显微镜（TEM）或扫描电子显微镜（SEM）对样本的分析，证明其扭曲形态为右手螺旋（图1b，c）。在本研究中分析的所有三名阿尔茨海默病（AD）患者的纤维提取物中，均观察到一致的右手螺旋扭曲，这与体外形成的Aβ纤维的左手螺旋扭曲截然不同（图1b，c）。脑源性Aβ纤维还对蛋白酶K具有抗性，能够在易降解体外形成Aβ纤维的蛋白酶解条件下存活。

形态I纤维的冷冻电子显微镜（Cryo-EM）结构

冷冻电子显微镜（Cryo-EM）显示，脑源性Aβ纤维具有多态性（图2a）。在我们的样本中，一种称为形态I的纤维形态相对丰富，其宽度相对较小，为7.4 ± 0.4纳米，且交叉距离较短，为41.5 ± 2.3纳米。二维分类平均值显示，β-链在纤维z轴方向上呈交错排列，表明存在一个伪21螺旋轴。基于0.143傅里叶壳相关性（FSC）标准，我们采用这种对称性重建了分辨率为4.4 Å的纤维三维（3D）图。三维图显示了肽分子在纤维z轴方向上的清晰分离（图2b），使我们能够获得有效的纤维结构分子模型。该模型的Molprobity得分为2.64，且没有C-β偏差、拉马钱德兰图或旋转异构体外值。模型密度的二维投影与平均二维分类及其功率谱高度一致。重建的三维图与模型相比，分辨率为4.5 Å。

该纤维由两叠肽组成。纤维的横截面层包含两个Aβ(1–40)分子，它们填满了整个密度区域（图2c，d），表明不存在主要的无序区域。在肽的C末端，三维图的分辨率较低，这与第37位和第38位氨基酸残基处的双甘氨酸（Gly）序列以及通过质谱观察到的肽C末端异质性相一致。每个肽叠层包含四个交叉β片层，这里称为β1–β4，它们分别在第2–8位、第10–13位、第15–19位和第32–34位氨基酸残基之间延伸（图3a，b）。就氢键结合的β-链彼此之间的方向而言，β-片层是完全平行的（图3a）。β-片层的扭曲为右手螺旋（图3c），其扭曲方向是沿着主纤维轴观察的方向确定的。脑源性Aβ纤维的这一特性与体外形成的Aβ(1–40)或Aβ(1–42)纤维截然不同，后者具有左手螺旋扭曲的β-片层，也与上述定义中球状蛋白中β-片层扭曲的经典方向（左手螺旋）不同。

β-链的主链Ψ/Φ二面角在拉马钱德兰图中的分布向对角线的左侧强烈延伸（图3d）。这种分布是右手螺旋扭曲β-片层的特征。四个β-片层内残基的Ψ + Φ总和的平均值为负（−2.2 ± 17.9°），因此与人全身性AA淀粉样变性中右手螺旋扭曲的淀粉样纤维所获得的−2 ± 20°的值相似。相比之下，小鼠全身性AA淀粉样变性中的左手螺旋扭曲淀粉样纤维的值为正（+8 ± 20°）。模型的主链构象与纤维的右手螺旋扭曲（图1b，c）相对应，这进一步证实了模型的正确性。

肽的折叠呈C形。其N端和C端形成拱形，肽链折叠回到中央肽域。后者埋藏在纤维核心中，形成两个肽叠层之间的相互作用位点（图3e）。接触位点包含疏水性和极性氨基酸残基（图3e）。中央接触位点靠近纤维主轴，由第24–26位氨基酸残基形成（图3e）。两个相同的外径接触位点涉及β3和β4片层之间的跨叠层异型拉链（图3a）。接触位点被两个发生在两个肽叠层界面处的小空腔隔开。叠层之间偏移约2.41 Å（图2e），对应于纤维的伪21螺旋对称。Aβ肽的已知突变变体大多数影响肽的N端拱形（图3f）。

肽的N端和C端比中央域更多地暴露于溶剂并且更容易接触（图3e），这与通过质谱法证明的末端蛋白酶解修饰相一致。除了一个包含His6、His13、Glu11和Lys16的簇埋藏在N端拱形内之外，大多数带电氨基酸的侧链都暴露于溶剂。Glu11和Lys16的取向使得它们可以相互形成盐桥。每个Aβ分子在纤维z轴方向上显示出约6 Å的高度变化，这在空间上使纤维交错，并在纤维两端产生不同的尖端结构。高度变化特别显著地发生在N端拱形内，导致来自第i层的β1链与来自第i + 1层的β3链之间发生分子间相互作用。

脑源性Aβ纤维的多态性

除了形态I之外，我们还能在我们的样本中辨别出另外两种丰富的纤维形态，这里分别称为形态II和形态III（图4a）。形态II的宽度为12.3 ± 0.6纳米，交叉距离为129.0 ± 10.5纳米，而形态III的宽度为17.9 ± 0.6纳米，交叉距离为142.8 ± 12.3纳米（图4b）。这三种纤维形态占我们样本中观察到的纤维结构的75%以上（图4c），并且存在于本研究调查的所有三位阿尔茨海默病患者（Alzheimer's disease, AD）的纤维提取物中。形态II和III的三维（3D）图谱的冷冻电子显微镜（Cryo-EM）重建分别达到了5.65和7.01埃（Å）的空间分辨率。根据二维（2D）类平均图像中链的交错排列，在这些重建中采用了伪21螺旋对称。这两种纤维形态具有极性，并包含形状相似的原纤维（Protofilament, PF）。每个PF的横截面尺寸为4.1 × 7.6纳米，这与形态I的整个横截面尺寸相对应（图4d）。形态II和III的PF内部结构类似于形态I的3D图谱中看到的横截面细节。

纤维形态I的肽模型与纤维形态II和III的3D图谱非常吻合（图4d）。尽管我们的数据分辨率不足以揭示肽构象因其不同的结构环境而发生的任何小结构重排，但显然这三种纤维形态都可以用相同的Aβ肽基本构象来解释。因此，脑源性Aβ淀粉样纤维的多态性主要来源于具有相似结构的PF数量的变化。纤维形态I包含一个PF，而纤维形态II和III分别包含两个或三个PF。不同纤维形态中PF结构或肽折叠保持不变的结论进一步得到了以下证据的支持：与形态I相对应的细丝可以从形态II的末端发出（图2a）。纤维形态II和III具有非常相似的PF-PF界面。这些界面由相邻PF的β1片层的面对面堆积形成。β-片层的取向使得相邻PF中的Glu3和Arg5残基相互补偿电荷（图4e），类似于小鼠AA淀粉样纤维PF-PF界面处的盐桥。

【讨论】

在这项研究中，我们分析了阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）脑组织中的Aβ淀粉样纤维的结构形态。我们表明，脑源性Aβ纤维包含多种纤维形态。对于纤维形态I，我们获得了一个结构模型，该模型确定了肽的折叠方式、纤维在存在两个相等肽堆叠方面的层次组装、纤维的右手扭曲、伪21螺旋对称性和纤维的极性。该模型的稳健性得到了其与实验验证的二维（2D）类平均值和功率谱的一致性、与三维（3D）图谱相比的FSC值为4.5以及忠实反映脑源性纤维右手扭曲拓扑结构的Ψ/Φ角分布的证实（图3d）。然而，我们的模型在多肽主链和氨基酸侧链的详细几何结构方面仍存在不确定性。观察到的C形肽折叠是新颖的，不同于之前描述的体外形成的Aβ结构。我们纤维结构的独特特征是N端拱形和24–26位残基的中心位置，这与之前描述的Aβ纤维形成对比，后者中30–42位残基构成了最中心的结构元素。

形态I中的肽折叠与通过形态II和III获得的纤维三维（3D）图谱高度吻合。尽管后两者的3D图谱分辨率低于形态I，但可以明确的是，在所有三种纤维形态中，一般的多肽折叠（PF）结构都是保守的，它们的主要区别在于PF的数量。这三种纤维结构占我们样本中可见纤维的大多数（图4c），这表明所描述的结构代表了患者脑中的Aβ淀粉样纤维。在本研究的所有三名阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）患者的纤维提取物中均一致发现了这三种纤维形态。因此，它们并非患者特异性的。然而，不能排除脑中可能存在其他Aβ纤维形态的可能性，例如，在受特定肽突变体影响的患者中。

在Aβ肽的序列中已描述了14种突变。据报道，其中12种突变可促进AD和/或脑淀粉样血管病（cerebral amyloid angiopathy, CAA），而Ala2Thr具有保护作用，His6Arg的相关性则不确定。将这些突变映射到我们的结构上，大多数突变没有明显的稳定或不稳定作用（图3f）。这一观察结果与细胞生物学研究结果一致，这些研究表明它们可能主要影响Aβ肽的蛋白水解生成。或者，一些突变可能只是普遍促进聚集，而非特定纤维形态。只有三种突变会诱导或消除接触，这可能会导致结构不稳定：Glu11Lys和Lys16Asn破坏了N端拱内的盐桥，而Leu34Val则去除了C端拱内的一个亚甲基。然而，前两种突变被描述为影响Aβ的蛋白水解过程，而后一种突变则促进CAA而非预防CAA。

观察到的脑源性纤维一个特别有趣的结构特征是它们的右手扭曲。这一特性与先前描述的体外形成的Aβ(1–40)和Aβ(1–42)纤维的左手扭曲截然不同，甚至与呈现强烈偏好相反扭曲β-片层的球蛋白结构也大相径庭。本研究是第二种人类致病性纤维蛋白与体内右手扭曲淀粉样纤维相关的情况。第一种是人类系统性AA淀粉样变（常见变体）中的血清淀粉样A蛋白。尽管右手扭曲的分子起源尚待确定，但Aβ（图3d）和AA淀粉样纤维24的拉马钱德兰图（Ramachandran plot）中Ψ/Φ对的分布表明，纤维蛋白的折叠诱导了右手扭曲。与这一观点一致的是，我们的肽折叠与先前描述的左手扭曲Aβ纤维中观察到的肽折叠有很大不同。

这些发现强调了在使用患者源性淀粉样纤维研究疾病结构基础时的重要性。之前对其他几种纤维蛋白也得出了类似的结论，这些纤维蛋白也被发现能在体外形成形态上不同于其人类致病对应物的纤维结构。然而，断定体外形成的纤维必然不同于患者纤维还为时过早。相反，我们得出的结论是，在这些特定情况下，观察到的差异反映了体外纤维形成条件与体内纤维形成条件不完全匹配。因此，它们导致了不同的纤维形态，这与淀粉样结构由宿主和种子决定的观点一致。

结合几篇最近的出版物，我们的数据支持了这样一个概念：病理源于特定的纤维形态或纤维蛋白构象。首先，虽然之前的Aβ体外纤维化研究已明确表明，该肽能够形成形态各异的多种纤维结构，但我们在这里表明，病理仅与某些结构相关的纤维形态相关。这些纤维形态在呈现相同神经病理学的患者纤维提取物中一致出现。其他纤维系统也有类似的观察报告，包括人类ATTR和AA淀粉样变，以及tau依赖性神经病理学。甚至患有系统性AA淀粉样变的小鼠也与不同动物体内一致的纤维形态相关。其次，最近对小鼠AA淀粉样纤维的冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构研究表明，某些小鼠品系对系统性AA淀粉样变的抗性并非源于变体血清淀粉样A蛋白普遍无法形成交叉β-纤维，而是源于它们与病理相关纤维形态的不相容性。第三，疾病的不同变体可能与不同的纤维形态相关。这方面的例子包括遗传性ATTR淀粉样变中的A型和B型淀粉样纤维、系统性AA淀粉样变“常见”和“血管”变体中的不同纤维，或不同形式神经退行性疾病中不同的tau纤维形态。这些观察结果的结论是，使用适当选择性的抑制剂靶向特定的纤维形态可能是一种干扰疾病进程的诱人策略。本研究现在为Aβ提供了更精细的结构信息。

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