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1. 偶联剂SMCC（Succinimidyl 4-N−Maleimidomethylcyclohexane-1-carboxylate）是一种具有N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯和马来酰亚胺基团的异型双功能交联剂。
1.1 基本信息
名称：4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯
别名：N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯, SMCC
CAS号：64987-85-5
分子式：C16H18N2O6
分子量：334.32
溶解性：难溶于水，通常需要先溶于有机溶剂如DMSO（二甲基亚砜）或DMF（N,N-二甲基甲酰胺）中。
储存温度：4°C 下干燥储存
间隔臂长：8.3 Å
细胞渗透性：是
1.2 化学性质与反应特性
SMCC是一种功能强大的异型双功能交联剂，它巧妙地结合了N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯和马来酰亚胺基团，这一独特的化学结构使得SMCC能够在生物分子之间建立稳定的共价偶联，特别是那些含有胺基和巯基的分子。在适宜的pH值范围（7–9）内，NHS酯部分能够高效地与伯胺反应，形成牢固的酰胺键；而马来酰亚胺部分则在6.5–7.5 pH范围内，与巯基发生特异性结合，生成稳定的硫醚键。
值得注意的是，尽管马来酰亚胺基团相较于NHS酯基团更为稳定，但在pH值>7.5的条件下会缓慢水解，从而丧失对巯基的反应特异性。因此，为了最大化SMCC的偶联效率，通常选择在pH 7.2–7.5的条件下进行反应，并且NHS酯（针对胺基）反应在马来酰亚胺（针对巯基）反应之前或同时发生。此外，SMCC分子中的环己烷环结构起到了降低马来酰亚胺基团水解速率的关键作用，这一特性使得经过SMCC活化的马来酰亚胺蛋白能够稳定地储存，即使经过冻干处理，也能在后续与含巯基的分子进行偶联时保持高效性。马来酰亚胺基团在 4°C 下于 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 值为7）中可保持稳定64小时。
2. 偶联剂Sulfo-SMCC（sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate）是SMCC的水溶性类似物。
2.1 基本信息
名称：磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐
别名：Sulfo-SMCC
CAS号：92921-24-9
分子式：C16H17N2NaO9S
分子量：436.4 g/mol
溶解性：≥10 mg/mL（溶于去离子水）
储存温度：-20°C 下干燥储存
间隔臂长：8.3 Å
细胞渗透性：否
2.2 化学性质与反应特性
磺基琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐 (Sulfo-SMCC) 是一种不可裂解和具有膜不可透过性的交联剂。反应特性与SMCC一样。因为它包含亲水磺酰基团，Sulfo-SMCC 在水和许多常用缓冲液中溶解多达10 mM，因此避免了使用可能会破坏蛋白结构的有机溶剂。另外如果目标蛋白的疏水性较强，为了避免在偶联过程中疏水聚集，建议使用Sulfo-SMCC。
3. 偶联剂SM(PEG)n是一系列通过含 n 等于 2 至 24 乙二醇单元的聚乙二醇间隔臂得到的长度从 17.6 至 95.2 埃不等的胺-巯基交联剂。
3.1 基本信息
别名：NHS-dPEG-Mal，Mal-PEG NHS 酯，琥珀酰亚胺-dPEG-马来酰亚胺
分子量：根据聚合度不一样而变化
溶解性：水溶性
储存温度：-20°C 下干燥储存
间隔臂长：17.6 ~ 95.2 Å
细胞渗透性：否
3.2 化学性质与反应特性
SM(PEG)n试剂是一种具有N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯基和马来酰亚胺基团的异双功能交联剂，可使含有胺基和巯基的分子发生共价偶联。各化合物具有相同的异型双功能结构（NHS-PEGn-马来酰亚胺），但离散乙二醇单元数量不同（n = 2、4、6、8、12 或 24）。使用聚乙二醇（PEG）作为间隔臂的交联剂是那些仅含纯烃类间隔臂试剂的便捷替代品。PEG间隔臂可以提高试剂和偶联物的水溶性，降低偶联物聚集的可能性，并增加交联的灵活性，从而降低间隔臂本身引起的免疫应答反应。使用含 PEG 的偶联剂对蛋白质进行修饰，以提供特异性优势。蛋白聚乙二醇化可以提高修饰蛋白的稳定性，使其免于被蛋白水解酶切，提高其在生物学的应用中的半衰期，掩盖其引起的免疫原性反应，降低其抗原性或潜在毒性，提高其溶解度，降低聚合的可能性，并能尽可能降低体外和体内应用的干扰。聚乙二醇具有无毒、无免疫原性，具有亲水性、水溶性且高度灵活等优点。
4. 偶联比例：
通常，与含胺蛋白的量相比，使用10至50倍的偶联剂达到摩尔过量，可以产生足够的马来酰亚胺活化，从而使多个含巯基的蛋白能够与每个含胺蛋白偶联。更稀的蛋白溶液需要更大的试剂摩尔过量倍数才能达到相同的活化水平。为了确定目标应用中的最佳活化水平和最终偶联比例，需要进行实验测试。
通用的推荐量如下，
• 对于<1 mg/mL的蛋白样品：使用40至80倍的摩尔过量。
• 对于1–4 mg/mL的蛋白样品：使用20倍的摩尔过量。
• 对于5–10 mg/mL的蛋白样品：使用5至10倍的摩尔过量。
注意：如果Sulfo-SMCC溶液未完全溶解，可将试管置于热水流下或用50°C水浴加热几分钟。
5. 偶联过程：
（1）将Protein-NH2溶解于结合缓冲液中，浓度为0.1mM（例如，对于50kDa的蛋白质，5mg溶于1mL缓冲液中），如有比较蛋白质可以先进行透析处理。
（2）向溶解的Protein-NH2中加入交联剂，使其最终浓度为1mM（对于0.1mM的蛋白质溶液，为10倍的摩尔过量）。
（3）在室温下孵育反应混合物30分钟，或在4°C下孵育2小时。使用用结合缓冲液平衡的脱盐柱去除过量的交联剂。
注意：请遵循脱盐柱产品说明书，以确定哪些组分含有Protein-NH2。或者，通过测量在280nm处有最大吸光度的组分来定位蛋白质；但请注意，NHS-酯离去基团在280nm处也有强烈的吸收。
（4）将Protein-SH和脱盐后的Protein-NH2按所需的摩尔比混合，该比例应与两种蛋白质上存在的巯基和活化胺的相对数量一致，以达到最终偶联物的期望比例。
（5）在室温下孵育反应混合物30分钟，或在4°C下孵育2小时。
注意：通常，让反应进行数小时或过夜也无妨，尽管反应通常会在规定时间内完成。若要在反应完成前停止偶联反应，请加入含有还原型半胱氨酸的缓冲液，其浓度应比Protein-SH的巯基浓度高出数倍。
注意：可通过电泳分离和随后的蛋白质染色来估计偶联效率。
6. 注意事项
• SMCC、Sulfo-SMCC和SM(PEG)n对湿度敏感。应干燥保存。在打开容器前，先将小瓶平衡至室温，以避免容器内部凝结湿气。溶解所需量的试剂，并在水解发生前立即使用。
• 注意：不要使用磷酸盐缓冲液（PBS）首次溶解Sulfo-SMCC；该试剂在总盐浓度超过50mM的缓冲液中溶解不佳。但是，一旦溶解，该溶液可以进一步用PBS或其他非胺类缓冲液稀释。
• 使用后，丢弃剩余的溶液。
• 在偶联过程中，避免使用含有伯胺（如Tris或甘氨酸）和巯基的缓冲液，因为它们会与预期反应竞争。如有必要，将样品透析或脱盐至适当的缓冲液中，如磷酸盐缓冲液（PBS）。
• 分子必须含有游离（还原）巯基才能与SMCC和Sulfo-SMCC试剂的马来酰亚胺部分反应。为了还原肽的二硫键，可以使用固定化TCEP二硫键还原凝胶。对于蛋白质，使用5mM TCEP在室温下还原二硫键30分钟，然后通过适当的脱盐柱过柱两次。请注意，完全还原蛋白质（如抗体）的二硫键可能会使其失活。IgG铰链区二硫键的选择性还原可以使用2-巯基乙基胺•HCl（2-MEA）实现。可以使用N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯（SATA）或2-亚氨基硫杂环戊烷•HCl向分子中添加巯基。
END
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