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在免疫反应过程中，根据是否需要进行多步清洗，可以将免疫反应分为一步法和两步法。一步法根据加样顺序，又有两种模式，一步法和一步延迟法。
1. 反应原理
一步法反应原理：样本中的待测抗体与固相载体上的捕获抗原以及标记物中的示踪抗原一起加入反应杯中反应，反应完成后，清洗掉多余的标记抗原、未被固相捕获的抗原抗体复合物，整个反应过程中只包含1步清洗。反应原理如下图：
一步延迟法反应原理：样本中的待测抗体与固相载体上的捕获抗原先反应，不清洗，加入标记抗原，反应完成后清洗去除多余的标记抗原、未被固相捕获的抗原抗体复合物，整个反应过程中只包含1步清洗。反应原理如下图：
两步法反应原理：样本中待测抗体与固相载体上的捕获抗原反应，清洗去除多余的待测抗体，再加入标记抗原，整个反应过程中包含2步清洗。反应原理如下图：
2. 适用范围
一步法、一步延迟法适用范围：（1）当待测物分子量非常大或者非常小时，这种情况下抗原抗体的亲和力可能不足，清洗次数太多可能导致待测物被清洗下来，表现出待测物浓度假性降低（大家可以想象一下我们用一只手去抓取大西瓜或者小芝麻，如果晃动的太厉害大西瓜和小芝麻可能会掉落）。（2）需要提升灵敏度时，由于一步法和一步延迟法反应时间较长，因此灵敏度较高。（3）使用一步法时如果HOOK效应不能满足要求，可以尝试使用一步延迟法。（4）竞争法一般都是一步法或者一步延迟法，有少许项目也可以用两步法。（个人观点，仅供参考）
两步法适用范围：（1）如果项目对特异性都要求较高时，尽量选择两步法。两步法有两步清洗过程，干扰更小，因此特异性更好。（2）需要避免HOOK效应时。（两步法也有HOOK效应，两步HOOK效应与一步法HOOK效应原理不一样，笔者后期专题讨论）（3）如果三种方法都可以选时，首选两步法。（4）间接法、捕获法必须使用两步法。（个人观点，仅供参考）
3. 优缺点
一步法优点：（1）快速，反应模式简单。快速模式一般都使用一步法。（2）反应时间长，灵敏度更高。
一步法缺点：（1）易受RF、HAMA、异嗜性抗体等的干扰。（2）易产生HOOK效应（在生物样本中并不是所有一步法都有HOOK效应，生物样本中待测物质浓度可能没有达到引起HOOK效应的浓度）。（3）样本、固相端、标记端一起反应，易受环境影响，反应的可控程度较低，难以进行精确定量。
一步延迟法优点：（1）固相端反应时间与一步法一样，标记端反应时间比一步法短，因此HOOK效应比起一步法，会有所改善。（2）优先竞争法只能使用一步延迟法。
一步延迟法缺点：（1）缺点与一步法一样，易受RF、HAMA、异嗜性抗体等的干扰。（2）不能完全杜绝HOOK效应。
两步法优点：（1）特异性好，与一步法相比多一步清洗，可以有效减少干扰物质。（2）反应的可控程度较高，便于进行精确定量。
两步法缺点：（1）对抗原抗体的要求较高，导致成本较高。（2）操作更复杂，对仪器的要求较高。（3）耗时长，由于操作步骤较多，且清洗次数多，因此耗时更长。
总之，一步法、一步延迟法和两步法在免疫学检测中各有其特点和适用场景。一步法操作简便、快速、成本低，适合快速检测，但特异性相对较低，难以实现精确定量。而两步法虽然操作较为复杂、耗时且成本较高，却提供了更高的灵敏度和特异性，且能够进行精确的定量分析，更适合深入研究和精确诊断。因此，在选择一步法、一步延迟法或两步法时，应根据实际的情况来决定使用哪种方法，以获得最佳的检测结果。
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