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【摘要】
各种细胞分泌的小细胞外囊泡（SEVs）是脂质双层囊泡，大小为30–150纳米，可将蛋白质、核酸和脂质作为货物运送到其他细胞。它们包括外泌体，后者是在多泡体（MVEs）内生成并在多泡体与质膜融合时分泌出来，以及部分直接从质膜出芽的微囊泡。由于已证实SEVs参与癌症、神经退行性疾病和免疫等许多疾病和生理现象中的细胞间通讯，它们已成为诊断和药物发现靶标的关注焦点。SEVs有五种分离方法，包括超速离心、密度梯度超速离心、聚合物沉淀、亲和分离和分子排阻色谱。亲和分离法使用与抗体等结合分子偶联的磁珠分离SEVs，具有分离高纯度SEVs的特点。然而，SEVs的数量受到结合分子的限制，并且很难从抗体磁珠上洗脱完整的SEVs。在本章中，我们介绍了一种靶向SEV膜成分磷脂酰丝氨酸（PS）的TIM4亲和分离法。TIM4以钙离子依赖的方式与PS结合，从而在螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）存在的情况下，能够从TIM4磁珠上洗脱完整的SEVs。TIM4亲和分离法有助于克服亲和分离法的缺点，能够以高纯度分离异质SEVs。该方法将促进SEVs的功能分析、诊断方法的开发以及工程化SEVs的药物研发。
1.介绍
我们体内的60万亿个细胞通过细胞间黏附、分泌蛋白和细胞外囊泡（EVs）不断相互通信，从而维持内稳态。分泌蛋白和EVs不仅向周围细胞传递信息，而且还向远处细胞或组织传递信息。EVs是具有脂质双分子层的囊泡，含有作为信号传递介质的蛋白质、核酸和脂质。EVs向细胞的递送由表面蛋白质和脂质分子控制，例如，通过整合素实现EVs向肺部或肝脏的特异性递送。受体细胞通过与EVs的表面相互作用或通过内吞作用或膜融合将EVs纳入的方式接收信息。前者作为B细胞或树突状细胞通过EVs向T细胞呈递抗原和Fas配体诱导凋亡而广为人知，而后者作为EVs中所含microRNA对基因表达的调控而广为人知。因此，通过EVs进行的细胞间通信是精确编程的，并且在诸如癌症、神经退行性疾病和免疫等不同的生物现象中发挥着重要作用。此外，目前的研究还集中在工程化EVs的药物开发以及分析血液、尿液和脑脊液等体液中EVs的诊断方法开发上。
根据产生和分泌机制的不同，EVs通常分为三类：外泌体、微囊泡和凋亡小体（图1）。外泌体是源自多泡体（MVEs）的30–150纳米大小的囊泡。MVEs通过内部产生多个腔内囊泡从晚期内体成熟而来；这一过程由转运所需的内体分选复合物（ESCRT）介导。CD9、CD63和CD81等四跨膜蛋白、ESCRT蛋白和热休克蛋白是众所周知的标志物蛋白，但它们也表达在其他EVs中。已知存在一些缺乏标志物的外泌体，这给下文描述的亲和纯化方法带来了问题。微囊泡是直接从质膜出芽的100–1000纳米大小的囊泡[。微囊泡不仅表达包括选择素和整合素在内的常见标志物，还表达四跨膜蛋白。凋亡小体是在凋亡过程中直接从质膜释放的300纳米–5微米大小的囊泡。微囊泡含有与外泌体在大小和标志物上相似的囊泡，因此无法在从细胞分泌后区分这些囊泡。因此，许多研究人员将直径约为100纳米的囊泡定义为小细胞外囊泡（SEVs），而将直径为几百到1000纳米的囊泡定义为大细胞外囊泡（LEVs）（图1）。
图1 细胞外囊泡的生成。凋亡小体由DNA损伤、内质网应激等因素诱导的凋亡细胞分泌。微囊泡则是细胞通过质膜直接出芽的方式分泌的。外泌体是通过质膜与由晚期内体通过产生多个腔内囊泡而成熟的多泡体融合后，从细胞中分泌出来的。直径约为100纳米的囊泡，包括外泌体和部分微囊泡，被称为小细胞外囊泡（SEVs）。直径在几百到1000纳米之间的囊泡，包括部分微囊泡和凋亡小体，被称为大细胞外囊泡（LEVs）。
细胞培养基或体液中含有细胞、细胞碎片、大细胞外囊泡（LEVs）、小细胞外囊泡（SEVs）和分泌蛋白。为了从样本中分离出所需的EVs，首先进行一系列离心步骤，分别在300g、2000g和10,000g的离心力下沉淀细胞、细胞碎片和LEVs，从而使分泌蛋白和SEVs保留在上清液中（图2）。为了从上清液中分离出SEVs，至少采用以下五种方法中的一种：超速离心、密度梯度超速离心、聚合物沉淀、尺寸排阻色谱或亲和分离。每种方法在纯度、EV群体和时间方面都有不同的特点，因此选择适合特定目的的分离方法非常重要（表1）。超速离心是一种标准方法，通过以100,000g的离心力对上清液进行离心，使SEVs沉淀。使用该方法可以回收异质SEVs，但纯度适中，重现性不佳。密度梯度超速离心法通过使用蔗糖溶液密度梯度对上清液进行超速离心，将SEVs与其他污染物分离。使用该方法可以以高纯度回收异质SEVs，但操作复杂，且超速离心耗时较长。在聚合物沉淀法中，将上清液与聚乙二醇（PEG）等聚合物溶液混合，通过低速离心使SEVs聚集并沉淀。使用该方法可以容易地回收异质SEVs，但由于大蛋白以与SEVs相似的方式聚集，因此纯度非常低。尺寸排阻色谱法是一种使用装有小孔载体的色谱柱，根据尺寸差异将SEVs与蛋白质分离的方法。该方法可以容易地以中等纯度提取异质SEVs。在亲和纯化法中，使用与SEVs表面标记抗体偶联的磁珠来分离SEVs。虽然使用该方法可以以高纯度回收SEVs，但只能回收标记阳性的SEVs。此外，SEVs需要用酸性缓冲液处理才能从抗体磁珠上分离下来，这可能会导致SEV功能丧失。在这里，我们介绍了一种TIM4亲和法，该方法克服了亲和纯化法的这些缺点，能够以高纯度纯化异质SEVs。
图2 使用离心法对样本进行分级分离。通过分别在300g、2000g和10,000g的离心力下进行一系列离心操作，将条件培养基或生物流体分级分离为细胞、细胞碎片、粗制大细胞外囊泡（LEV）以及分泌蛋白+粗制小细胞外囊泡（SEV）组分。
TIM4亲和纯化方法针对的是小细胞外囊泡（SEVs）和大细胞外囊泡（LEVs）脂质双层中的磷脂酰丝氨酸（PS）成分。在活细胞中，由于翻转酶的作用，PS仅存在于质膜内侧，但当其活性丧失时，PS会出现在SEVs的两侧。此外，由于大多数SEVs都含有PS，因此以PS为靶点的分离方法能够回收异质SEVs。存在多种PS结合物，包括膜联蛋白V、乳脂球表皮生长因子-8（MFG-E8）、TIM1、TIM3和TIM4；其中，TIM4与PS的结合亲和力最高，且依赖于钙离子（Ca2+）。这一特性使得能够使用TIM4磁珠高效捕获SEVs，然后使用乙二胺四乙酸（EDTA）溶液从TIM4磁珠上洗脱完整的SEVs。换言之，TIM4能够克服亲和分离方法的缺点，包括EV群体受限以及在苛刻条件下洗脱EV。此外，TIM4亲和纯化方法可用于分离LEVs和凋亡小体，而其他纯化方法则专门针对SEVs。此外，TIM4对PS的高亲和力使得能够使用涂有TIM4的板进行高灵敏度的酶联免疫吸附试验（ELISA）来量化EV。TIM4亲和分离方法和TIM4亲和EV-ELISA是功能分析EV、开发针对EV的诊断方法以及开发工程化EV药物的强大工具。
表1 外泌体分离方法的特点
该文内容还包含TIM4亲和珠的制备、使用TIM4亲和珠分离高纯度细胞外囊泡（EVs）、使用BCA法测定细胞外囊泡中的蛋白质含量、使用TIM4亲和细胞外囊泡酶联免疫吸附试验（EV-ELISA）对细胞外囊泡进行定量等内容，感兴趣的朋友自行学习。
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原文信息:
Yoshida T, Hanayama R. TIM4-Affinity Methods Targeting Phosphatidylserine for Isolation or Detection of Extracellular Vesicles. Methods Mol Biol. 2022;2466:23-36. doi:10.1007/978-1-0716-2176-9_2
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