Adv Exp Med Biol（IF 2.1）：铁蛋白的自组装：结构、生物功能及其在纳米技术中的潜在应用

【介绍】

大自然利用蛋白质的自组装特性产生了各种各样的大型、复杂且高度对称的蛋白质结构。理解自组装的细节不仅对基础科学至关重要，而且对于构建极具挑战性的技术（如可编程纳米机器）也至关重要。

天然蛋白质由氨基酸组成，形成多肽链，然后折叠，从而产生稳定的蛋白质三维结构。蛋白质折叠的热力学特性使得其中的一些残基在表面定向并伸出，以便它们能与其他蛋白质相互作用。因此，分子生物学中由遗传密码开始的中心法则所定义的信息流可以通过蛋白质折叠进一步扩展到蛋白质-蛋白质相互作用的领域。这些蛋白质-蛋白质相互作用是大型复杂大分子蛋白质结构自组装的基础。

蛋白质的自组装可以产生具有广泛生物功能的各种超分子结构。这些复合物包括丝状结构、蛋白质晶格和对称笼状结构。在不同的超分子蛋白质复合物中，蛋白质笼可能是最复杂的，基于蛋白质的结构。它们由少数亚基自组装成对称、单分散的结构，激发了众多学科科学家的灵感。从病毒衣壳到细菌微区室（如羧酶体），自然界中笼状结构丰富多样。在伴侣蛋白、DNA结合蛋白和铁蛋白（图10.1）中也观察到了笼状结构。研究发现，大多数蛋白质笼是中空且呈球形的（尽管也存在一些值得注意的例外），并且通常具有内部对称性，如二十面体、八面体或四面体，这在控制其亚基间相互作用中起着重要作用。在过去的二十年里，蛋白质笼已被开发为纳米材料合成的平台，这主要得益于它们在尺寸、形状和结构上的显著多样性。此外，它们易于在生物系统中大量生产，并且具有生物相容性，使其成为药物递送、细胞特异性靶向和酶催化的有吸引力的选择。在蛋白质笼中，铁蛋白因其独特的生物矿化能力和非凡的稳定性而最常被使用。

【历史背景】

铁蛋白于1937年首次被发现，并从马脾中分离出来。然而，人类血清中铁蛋白的存在更晚才被确定。迄今为止，铁蛋白家族是研究最多的蛋白质之一（可能是仅次于血红蛋白的第二大研究热点），血清铁蛋白仍被视为炎症、感染和恶性肿瘤的重要临床指标。尽管铁蛋白已被广泛研究，其临床意义也已确立多年，但关于铁蛋白生物学的许多基本问题仍有待解答，如其来源组织、分泌途径、相互作用伴侣、细胞表面受体及其降解途径等。1991年首次确定了铁蛋白的晶体结构，自那以后，包括动物、植物和细菌在内的不同生物体的铁蛋白已被分离、纯化和结晶。

铁蛋白通常存在于细胞质中；然而，最近又分离出了一种线粒体形式的铁蛋白。研究进一步表明，细胞外铁蛋白可以作为铁载体为细胞提供铁。与转铁蛋白（另一种铁储存蛋白）相比，转铁蛋白最多只能携带两个铁原子，而单个铁蛋白分子可以包裹多达4500个铁原子，因此它可能是一种非常有效的铁储存和输送系统。

【铁蛋白：基础生物学功能】

铁蛋白在所有生命形式（真核生物、古菌和细菌）中普遍存在；唯一的显著例外是酵母。从功能上讲，铁蛋白是一种铁储存蛋白，其在体内的作用是储存铁，以防止细胞内的金属毒性。研究进一步表明，铁蛋白不仅储存铁，还在其空腔内以水合氧化铁的形式矿化多余的铁。铁蛋白具有螯合铁的能力，这使得它能够在铁解毒和维持细胞铁储备方面发挥双重作用。值得注意的是，大多数哺乳动物铁蛋白可以由重链（H）或轻链（L）或两者共同构成。较重型的H异构体和较轻型的L异构体分别在心脏和肝脏中含量最为丰富。H和L亚基的分子量分别为21 kDa和19 kDa。负责H和L铁蛋白的基因分别位于人类基因组的11q和19q染色体上。在哺乳动物中，铁蛋白的H和L亚基之间的氨基酸序列相似性约为50%。H亚基通常包含高度保守的“铁氧化酶”氧化位点，该位点结合并氧化亚铁离子。L链铁蛋白由于不具有催化性的铁氧化酶中心，因此氧化铁的速度非常慢。各个亚基以四面体对称的方式排列，形成具有二重、三重和四重旋转对称轴的蛋白质笼。哺乳动物铁蛋白的蛋白质外壳通常是异质性的。复合物中H和L亚基的比例取决于这两种基因的相对表达，并且该比例因组织类型而异。相比之下，植物和细菌铁蛋白往往是同聚物。有趣的是，最常用的马脾铁蛋白大约含有90%的L亚基铁蛋白。两栖动物还有一种额外的（“M”）型铁蛋白；植物和细菌的铁蛋白与脊椎动物H型铁蛋白非常相似。

通常，铁蛋白笼包含24个蛋白质亚基，亚基通过二聚体中间体进行自组装，随后形成具有约12纳米外径和8纳米内腔的十二聚体笼，该内腔通常填充有氧化铁-羟基核心。没有无机核心的铁蛋白被称为脱铁铁蛋白。铁蛋白蛋白质笼在高达85℃的温度下稳定，并且在中性pH下能够耐受相当高水平的尿素、盐酸胍和许多其他变性剂。从天然来源分离铁蛋白大多数情况下会产生异质性，生成聚集的二聚体和三聚体。在自然界中，铁蛋白空腔用于矿化铁，尽管最近已经证明，该空腔还可以有效地用作反应容器，用于生成具有确定尺寸分布的不同金属纳米颗粒。

【铁蛋白家族】

铁蛋白超家族可分为三个主要亚类：经典铁蛋白（Ftn）、细菌铁蛋白（Bfr）和匮乏细胞中的DNA结合蛋白，也称为Dps（图10.2）。经典Ftn和Bfr蛋白属于大型铁蛋白家族，因为它们的结构略大。相比之下，Dps蛋白属于小型铁蛋白蛋白家族。有趣的是，这三个蛋白质亚家族都具有四螺旋束折叠结构。Bfr蛋白似乎与经典Ftn蛋白具有几乎相同的四级结构，并且都是由24个亚基组装而成；然而，细菌铁蛋白仅存在于古菌和细菌中。Bfr和Ftn之间的主要区别在于是否含有血红素部分：Bfr含有12个血红素基团，而经典铁蛋白的结构中则不含血红素分子。铁蛋白超家族的其他主要成员是Dps蛋白，与Ftn相比，它们形成较小的笼状结构，铁储存能力较低，并且包含一个独特的铁氧化酶位点。Dps蛋白由12个亚基组成，其主要功能是防止过氧化氢和铁产生有害的芬顿反应，从而保护DNA免受铁诱导的氧化损伤。Dps的每个单体也具有四螺旋束折叠结构，这是铁蛋白超家族的典型特征（图10.3a）。Dps蛋白不仅保护细菌免受氧化损伤，还能与DNA形成高亲和力复合物，且没有明显的序列特异性。大肠杆菌Dps的晶体结构（蛋白质数据库登录号：1DPS）显示为一种具有四面体点群对称性的空心蛋白质，证实Dps是铁蛋白家族的结构类似物。

一般来说，Dps十二聚体笼的直径约为9纳米，中心空腔约为4.5纳米，可容纳多达500个Fe3+铁离子。Dps的主要功能不是储存铁，而是保护细胞免受铁介导的氧化损伤。Dps的三重通道孔道内排列着带负电荷的N端残基，并产生静电势，从而促进铁进入蛋白质内腔；这一特征在大型和小型铁蛋白中都观察到。Dps的C端形成的孔道所含负电荷较少，且由于疏水收缩而较小（图10.3b），因此可能不参与铁的转运。大型和小型铁蛋白蛋白折叠成非常相似的单体结构，包含四螺旋束，但它们的组装结构不同。尽管它们都形成笼状结构，但包含的亚基数量不同，对称性也不同。

【铁蛋白结构】

在核酸和氨基酸水平上，铁蛋白的序列同一性较低，但其整体折叠（三级结构）却高度保守，这可能表明单体折叠方式相同或相似。然而，如上所述，它们自组装形成的笼状结构可能差异很大。根据其晶体结构，H型铁蛋白是一种由24个亚基组成的具有八面体对称性的空心球状蛋白质笼，分子量约为500 kDa，在生理pH值下带负电荷（图10.4a，b）。晶体结构进一步揭示，铁蛋白是一种α-螺旋蛋白质，α-螺旋含量约为70%。

每个H型铁蛋白亚基通常包含174个残基，这些残基可进一步细分为五个α-螺旋，称为A–E；每个螺旋对应的残基编号分别为14–40、49–76、96–123、127–161和163–173。螺旋A-D构成了一个由四条平行和反平行螺旋组成的长中央束，这是铁蛋白超家族的标志，而第五个短螺旋E则与α-螺旋束的一端相接（图10.5a）。在N端和C端以及AB、CD和DE螺旋之间的右旋转折处还存在额外的短非螺旋区域（后者特别紧密）。长BC环（残基78–94）连接B和C螺旋，并为结构提供了灵活性。晶体结构进一步揭示，螺旋A和C的大部分、BC环和N端都暴露在分子的外部，而螺旋B和D则朝向内部。His 136处的氢键断裂是长D螺旋产生弯曲的原因。D螺旋的弯曲发生在所有三个亚基在三重轴附近相交的重要位置，允许形成通道而不会破坏结构中其余螺旋的堆积（图10.4c）。

铁蛋白的每个亚基大致呈圆柱形，长度为50 Å，直径为25 Å，在每个亚基内部存在广泛的侧链相互作用。在经典铁蛋白和细菌铁蛋白中，四螺旋束并没有统一的疏水核心。在螺旋束的两端，许多侧链交叉并形成紧密堆积的疏水内部（图10.5b）。每个铁蛋白亚基的中心亲水区域位于这两个疏水核心之间。在这个区域中，有许多埋藏的极性和181个亲水残基，它们形成了氢键网络，有趣的是，H和L亚基之间的大部分结构差异都位于这一部分。

铁蛋白超家族的第二个特征性结构特征是易于形成二聚体。尽管寡聚化的整体途径仍不清楚，但人们普遍认为二聚体几乎肯定是第一个中间体。二聚体进一步组装成6聚体作为下一个中间体，6聚体可以直接形成，也可以通过4聚体形成6聚体，这两种方式的概率相等。组装途径中的下一个显著中间体是12聚体，它是通过两个6聚体的对接形成的。二聚体界面涉及螺旋A和B；BC环、N端和AB转折也参与相互作用，主要通过两个亚基之间广泛的氢键相互作用。

如前所述，24个铁蛋白亚基各自包含一个具有左手扭曲的四螺旋束，这些螺旋束以12对反平行的方式排列，形成菱形十二面体结构（空间群F432）。由此在三重轴上形成了8个漏斗状的亲水通道。而在四重轴上的其余6个通道则被C端的短E螺旋所包围，这些E螺旋与其他四个长螺旋之间的角度接近60°，并提供了一个由亮氨酸残基组成的疏水区域。位于四重轴上的通道并不参与铁的交换，尽管它可以启动质子的传递。在三重轴和四重轴上发现的通道宽度大约为0.4纳米（图10.4d）。铁几乎只通过三重轴的内部进入。与H链相比，L链铁蛋白的结构更为有序，这可能是其成为成核位点首选位置的原因。通过改变缓冲液的pH值至pH 2，然后再将其提高至pH 7以上，可以拆卸和重新组装铁蛋白。在重新组装过程中，溶液、溶解的分子以及纳米颗粒都很容易被困在铁蛋白内部。这是一种将材料封装在铁蛋白内部的有效方法，而这些材料通常无法通过孔隙之一渗透到蛋白质壳的内部。

在人类铁蛋白中，三个单体在N端于蛋白质笼表面形成三重局部对称，这三个单体的N端氨基酸之间的距离为5纳米。在C端，四个单体进一步在笼表面形成四重局部对称，这四个单体环的相同氨基酸之间的距离约为1纳米。因此，当单体自组装成蛋白质笼时，融合到铁蛋白单体N端或C端的受体或配体总是彼此靠近，从而以协同方式增强亲和力。最近，从古菌（如灿烂球菌）中获得了一种非常有趣的铁蛋白变体。经表征发现，该变体在溶液中保持为二聚体形态，并且仅在存在高盐浓度（单价或二价阳离子）时才组装成非典型的24聚体笼。这种铁蛋白中24个亚基的排列方式很独特，它们组装成一个四面体对称结构。它还具有四个直径约为45埃的大型三角形开口，这在铁蛋白家族中也是独一无二的。

【铁蛋白在纳米技术中的应用】

铁蛋白因其具有诸多优势，已成为生物纳米技术领域各种应用研究的热点。首先，铁蛋白具有高度对称的结构，且化学和热稳定性显著。其次，铁蛋白笼可通过控制重组进行再构建。第三，多种金属可在铁蛋白腔内装载并矿化。第四，通过重组基因方法添加肽或蛋白质标签，可轻松修饰铁蛋白笼的内表面和外表面。最后，与其他蛋白质笼相比，铁蛋白具有高度的生物相容性和较低的免疫原性。这些特性使铁蛋白成为药物递送的理想载体和疫苗开发的支架。此外，体外矿化的可塑性使铁蛋白成为细胞和医学成像的理想候选材料。

半导体（量子点）矿化所得的纳米粒子前景广阔，因为其荧光特性与纳米粒子的尺寸和形状相关。在此背景下，铁蛋白具有极高的相关性，因为它已被长期用于合成半导体纳米粒子。然而，该过程的主要缺点是化学反应过程中高浓度的过渡金属离子会诱导离子聚集。最近，山下等人改进了这一方法，通过采用缓慢化学反应法成功地在铁蛋白腔内矿化了CdSe和ZnSe。该方法可避免离子过度聚集，因为Cd2+和Zn2+被脱铁蛋白的负性内部残基所吸引，从而阻止了聚集过程；因此，在脱铁蛋白腔内矿化会减缓CdSe和ZnSe的聚集现象。

【铁蛋白和药物递送】

已发现具有天然结合金属倾向的药物，如顺铂、卡铂、去铁胺B和柔红霉素，可以轻易地被包裹在铁蛋白壳内。2007年，杨等人首次报道了顺铂的包封，同一研究小组还研究了这些纳米笼的细胞内化细节，以及载药纳米粒子在肿瘤治疗中的不同应用。其他研究也采用了相同的策略，并表明载顺铂的脱铁蛋白能够在胃癌细胞中诱导凋亡。最近，研究人员开发了一种针对黑色素瘤的药物递送装置，该装置使用载顺铂的铁蛋白，并通过化学方法连接了特异性靶向黑色素瘤抗原CSPG4的抗体。在另一项研究中，谢等人表明，在铜离子的辅助下，多柔比星也可以装载到RGD修饰的脱铁蛋白纳米笼上。根据他们的研究结果，这种载多柔比星的铁蛋白具有更长的循环半衰期、更高的肿瘤摄取率、更好的肿瘤（胶质母细胞瘤）抑制作用，以及比游离多柔比星更低的心脏毒性。其他靶向部分，如小分子、肽、抗体，甚至融合蛋白，已成功主要作为铁蛋白的N端融合物表达，使得24个靶向结构域能够以均匀且精确的方向暴露在铁蛋白表面。这些研究为使用铁蛋白提供了坚实的理论基础，特别是在针对如黑色素瘤这类在晚期完全抵抗化疗的癌症细胞时，提供了更优的治疗选择。

脱铁蛋白8纳米直径的内部空腔可以有效地用作纳米容器，并可以装载不同的货物分子。库特林等人已证明姜黄素和Gd-HPDO3A可以有效地装载到铁蛋白内，并可控地释放到目标细胞中。装载过程很简单，包括降低脱铁蛋白溶液的pH值，然后加入含有姜黄素和Gd-HPDO3A的溶液。然而，在极端pH值（pH 2）下分解铁蛋白纳米笼通常会对蛋白质笼结构造成不可逆的损害，并在球形蛋白质上形成孔洞。这种不可逆的损害将严重损害其体内稳定性和药物递送效率。最近，开发了一种替代且改进的方法，该方法对铁蛋白的结构损伤最小。在该方法中，通过用8M尿素处理蛋白质来实现铁蛋白的分解。经尿素处理后，由于亚基之间的静电相互作用减弱，脱铁蛋白的超分子结构发生坍塌，然后通过逐步透析去除尿素，从而允许铁蛋白笼重新组装。

【铁蛋白纳米粒子的表面修饰与细胞相互作用】

人类H型铁蛋白通过转铁蛋白受体1（TfR1）进入细胞。在与细胞表面结合后，H型铁蛋白-TfR1受体复合物被内化，并可在早期和循环核内体中轻易检测到。H型铁蛋白还与其他受体相互作用，如小鼠的TIM-2（T细胞免疫球蛋白区和粘蛋白区蛋白），该受体通常在B细胞中过度表达。最近，还确定了L型铁蛋白的目标受体（肝特异性SCARA 5受体，L链特异性），并对其细胞内化途径进行了详细研究。尽管铁蛋白本身具有靶向癌细胞的能力，但许多研究小组已通过化学或重组基因技术对铁蛋白的表面进行了修饰。铁蛋白已被修饰有各种设计的基序，包括抗体、肽和抗体片段，以便选择性地识别和靶向特定细胞。铁蛋白表面的赖氨酸或半胱氨酸残基可通过使用不同的异双功能交联剂（如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯和马来酰亚胺基团）进行化学偶联。赖氨酸和半胱氨酸残基还经过化学修饰，以连接染料、淬灭分子或聚乙二醇（PEG）。根据种类不同，某些铁蛋白的N端和C端暴露于表面（例如，在人类铁蛋白中，N端暴露于溶剂），众多研究表明，对该蛋白的N端和C端进行遗传修饰对蛋白质笼状结构没有影响。实际上，Kim等人已证明，铁蛋白的N端和C端均可进行修饰，以产生所谓的“双室铁蛋白”。在双室铁蛋白中，肿瘤靶向促凋亡肽与铁蛋白的N端融合，而绿色荧光蛋白（GFP）则与C端连接。铁蛋白N端的蛋白质融合可以在铁蛋白表面展示大分子蛋白质，如病毒血凝素，从而有效中和H1N1病毒。铁蛋白纳米粒子的C端肽融合也被用于各种应用，包括树突状细胞疫苗的开发[51]。除了这些融合方法外，还研究了在铁蛋白表面偶联靶向基团的其他策略，包括铁蛋白纳米笼的生物素化，以便插入靶向功能；将小分子适配体或抗体与铁蛋白偶联，然后使用选择性抗原进行捕获；以及对铁蛋白进行基因工程处理以生成融合蛋白，该融合蛋白利用N端连接的蛋白质G进行抗体固定。

【铁蛋白其他潜在的应用】

除了药物递送外，铁蛋白在磁共振成像（MRI）应用中也得到了广泛研究。MRI基于质子在外部磁场中从对齐状态受到射频脉冲扰动后的弛豫过程。进行MRI检查需要造影剂，造影剂可进一步分为两类：顺磁性造影剂（如钆（III））和超顺磁性造影剂（如氧化铁纳米颗粒（Fe3O4））。顺磁性造影剂在T1加权图像中呈现为亮色，因为它们会增加信号强度，而超顺磁性造影剂在T2加权图像中呈现为暗色，因为它们会降低信号强度。通常，生物样本的对比度取决于局部环境的水浓度变化和造影剂的浓度。含有氧化铁核心的铁蛋白长期以来被用作MRI成像的高弛豫率（T2）探针。磁铁蛋白的实验室合成方法简单直接，通常在氩气或氮气存在的厌氧条件下进行。反应产物是一种均匀的黑棕色溶液，与天然铁蛋白的血红色不同，该溶液可通过强磁场沉淀。磁铁蛋白的形成可通过透射电子显微镜最佳检测。最近，利用磁铁蛋白成功实现了动脉粥样硬化斑块的直接体内血管成像。此外，研究表明，铁蛋白还可用于在不使用任何造影剂的情况下可视化肿瘤组织。在这项研究中，在高结晶度的氧化铁纳米颗粒在铁蛋白内部空腔中合成的基础上，生成了各种肿瘤组织（包括乳腺癌）的高质量MRI对比图像。

【结论与铁蛋白在纳米生物学中的未来展望】

蛋白质纳米技术已成为医学、诊断和生物技术应用中一个颇具前景的领域。蛋白质笼状结构可能是蛋白质纳米技术中最精妙的设计，它们在提高生物利用度和降低某些已知细胞毒性药物的毒性方面非常有效。此外，特别是源自病毒的蛋白质笼状颗粒，已被发现在治疗流感、癌症和艾滋病等疾病方面极为有用。与其他载体相比，蛋白质笼状结构的优势包括高度可编程性、低免疫原性、高稳定性和生物相容性。这意味着使用蛋白质笼状结构可以实现特异性靶向，且毒性最小。在现有的不同蛋白质笼状结构中，铁蛋白在成像和药物递送方面似乎极为强大。近年来，已成功探索出将药物、分子和金属加载到铁蛋白中的不同策略。人们还广泛研究了增加封装分子类型的研究，特别是非金属药物的情况。然而，有些方面还需要进一步研究，如铁蛋白在体内释放药物的动力学机制。最近的研究还证实，H型铁蛋白能够特异性识别和结合转铁蛋白受体（TfR1）。有趣的是，TfR1在许多不同的癌细胞中过度表达。特异性靶向癌细胞受体可通过选择性抑制受影响的细胞来增强抗癌活性，并介导细胞毒性药物的选择性释放。还有报告表明，癌症受体靶向肽或抗体可以与铁蛋白进行基因融合，且基因修饰后的铁蛋白仍保持活性。然而，我们仍然不知道这些对铁蛋白的修饰如何改变封装纳米颗粒的免疫原性。另一个需要严格探索的方面是联合治疗的可能性。将不同药物封装到同一空腔中可能对不同疾病产生协同作用。铁蛋白在体内成像领域也有重要应用。过去10年中，已开发出许多不同的基于铁蛋白的造影剂，并用于磁共振成像（MRI），与目前临床上可用的造影剂相比，这些造影剂提供了更敏感的成像平台，并提高了肿瘤检测能力。然而，在将这些装载造影剂的纳米笼应用于临床之前，需要更深入地了解其毒性、生物利用度和清除情况。总体而言，铁蛋白已成为成像和药物递送领域一个非常有前景的平台。其生理特征（尤其是稳定性）和高可编程性使得铁蛋白纳米笼从实验室走向临床成为现实可能。最后，将成像和治疗功能结合到铁蛋白纳米笼中似乎是治疗领域最突出且最迷人的前沿。

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