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南京农业大学薛佳宇团队
于2024年8月
在Nature Communications（IF= 14.7）
发表中药分子机制研究
《The gradual establishment of complex coumarin biosynthetic pathway in Apiaceae》
伞形科复杂香豆素生物合成途径的逐步建立
原文链接：
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11316762/
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引用格式：
Huang XC, Tang H, Wei X, He Y, Hu S, Wu JY, Xu D, Qiao F, Xue JY, Zhao Y. The gradual establishment of complex coumarin biosynthetic pathway in Apiaceae. Nat Commun. 2024 Aug 10;15(1):6864. doi: 10.1038/s41467-024-51285-x. PMID: 39127760; PMCID: PMC11316762.
✦ 研究结果及亮点
✦
（复杂香豆素）complex coumarin生物合成途径（即CC生物合成途径）的演化：研究指出，伞形科（Apiaceae）植物中复杂香豆素（CCs）生物合成途径的形成和演化是通过特定酶编码基因的起源与丢失事件实现的。这些关键酶包括C2'H、C-PT和环化酶，它们通过基因复制和新功能化（neofunctionalization）在伞形科植物中独立起源。
基因复制事件：在伞形科植物中，C2'H、C-PT和环化酶基因的起源与异位复制和串联复制事件相关。这些复制事件导致了基因的扩增和功能分化，从而完成了CC生物合成途径的构建。
结构多样性的分子机制：C-PT基因在决定CCs线性和角型结构多样性方面起着关键作用。特别是，关键氨基酸变异（如Ala161/Thr161）在U6PT和U8PT酶活性转变中起着决定性作用。
生物合成基因簇（BGC）的作用：在前胡（P. praeruptorum）中发现的生物合成基因簇（BGC）可能解释了该植物为何能高度积累角型CCs。这种基因簇的形成可能增强了相应代谢途径的生物合成效率。
CC生物合成途径的分布与崩溃：并非所有伞形科植物都能产生CCs，这与某些关键酶基因的次生丢失事件有关。这些基因丢失事件导致了CC产物多样性的减少，甚至在某些植物中导致了CC生物合成途径的崩溃。
跨植物界CCs生物合成途径的平行演化：伞形科（Apiaceae）、芸香科（Rutaceae）、桑科（Moraceae）和豆科（Fabaceae）四个植物科中CCs生物合成途径的独立起源表明了跨植物界的CCs生物合成途径的平行演化。
基因型与表型的一致性：通过重建关键酶基因的演化历史，研究人员能够解释当前伞形科植物中CC存在/缺失的模式，并与这些植物中已知的代谢产物相一致，体现了基因型与表型之间的一致性。
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图 1.提出的伞形科 CC 的生物合成途径。
PAL 苯丙氨酸解氨酶、C4H 肉桂酸 4-羟化酶、4CL 4-香豆酸酯：辅酶 A 连接酶、HCT/HQT 羟基肉桂酰辅酶 A 莽草酸酯/奎恩酸羟基肉桂酰转移酶、CCoAOMT 咖啡酰辅酶 A O-甲基转移酶、C3'H 肉桂酰酯 3'-羟化酶、C2'H 对香豆酰辅酶 A 2'-羟化酶、F6'H 阿魏酰辅酶 A 6'-羟化酶、COSY 香豆素合酶、U6PT 伞形酮 6-异戊二烯基转移酶、U8PT 伞形酮 8-异戊二烯基转移酶、DC 脱美芽胞菌素环化酶、OC 骨醇环化酶。图片中的植物是新测序的 P. praeruptorum，富含所有香豆素类型，特别是高角度 CC 含量。
✦ 文章介绍
✦
复杂香豆素（CCs）是一类在伞形科植物中特有且具有显著药用价值的次生代谢产物，其生物合成途径与植物对病原体的防御和环境胁迫响应密切相关。
本研究通过基因组学和转录组学分析，结合系统发育树构建和基因功能验证实验，揭示了CCs生物合成途径中关键酶的起源和进化过程。通过对伞形科植物的系统发育分析，确定了CCs生物合成途径在伞形科中的进化轨迹，并通过体外酶活性实验验证了关键酶的功能。
该团队重构了伞形科中复杂香豆素生物合成通路起源与进化的详细过程，揭示了伞形科科内复杂香豆素生物合成起源及产物多样性的分子机制。
✦重点摘要
✦
1.伞形科物种的系统发育为研究CC生物合成的进化提供框架
研究通过整合34种伞形科植物的基因组和转录组数据，构建了一个高分辨率的系统发育树，为分析CC生物合成的进化提供了稳定的物种关系框架。新测序的(
前胡）P. praeruptorum基因组（1.74 Gb，33,420个蛋白编码基因）作为参考，显示其高度积累多样化CC产物。系统发育分析揭示了伞形科植物的CC积累主要集中在Apioideae亚科的特定支系中，而非均匀分布，表明CC生物合成途径可能在Apioideae后期进化中逐步建立。这一框架为后续研究提供了重要的时间框架和物种关系基础。
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图 2.伞形科植物的系统发育和香豆素分布。
系统发育分析和分歧时间估计基于来自 34 个被子植物的 1708 个精制低拷贝直系同源基因组。香豆素类型和分布信息是从14,66-85 收集的。'-' 无报告，SCs 简单香豆素，LFs 线性呋喃香豆素，LPs 线性吡喃香豆素，AFs 角呋喃香豆素，AP 角吡喃香豆素，WGD 全基因组重复。请见补充图。26-28 进行相关分析。星号代表 100% 支持。源数据作为 源数据 文件提供。
2.伞形科C2'Hs是在伞形科早期通过异位重复进化过程中产生的
C2'H是CC生物合成途径中的关键酶，负责将p-香豆酰辅酶A转化为伞形花内酯。系统发育分析显示，伞形科C2'H基因起源于Apioideae亚科的早期进化阶段，通过异位重复事件产生。这些基因在系统发育树中聚为一个单系群，表明它们具有共同的祖先。功能验证实验进一步证实了这些C2'H基因在体外具有催化活性，表明C2'H功能可能是通过早期的复制事件产生的。这一发现揭示了C2'H在CC生物合成途径中的关键作用。
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图 3.伞形科 C2'Hs 的系统发育分析和功能验证。
a 来自 154 个植物基因组和 17 个转录组的 2-OGD 基因家族的系统发育，见补充图。29 了解详细的系统发育。GenBank 登录号：PsC2'H，APP94171.1; PpC2'H， ASR80916.1;AtS8H，NP_187896.1 （AT3G12900.1）;GmF6'H， AHY03267.1;AtF6'H1， NP_187970.1 （AT3G13610.1）;AtF6'H2， NP_175925.1 （AT1G55290.1）
b 伞形科 F6'H 和 C2'H 的提取系统发育。绿点表示 C2'H 函数的来源。红色和紫色点分别表示相应的基因具有 C2'H 和 F6'H 功能。橙色五星代表已经发表的功能特征基因。
c 选定的伞形科 2-OGD 基因的 C2'H 活性测定。
d 选定的伞形科 2-OGD 基因的 F6'H 活性测定。标准品的液相色谱图及其相应的化学结构如图所示。伞形酮和东莨菪素的保留时间分别为 20.75 和 19.49 min。源数据作为 源数据 文件提供。
3.串联重复导致伞形科C-PTs的增加以及U6和U8PT的活性分歧
C-PT是CC生物合成途径中的另一个关键酶，负责催化伞形花内酯在C-6和C-8位置的前烯化反应，从而产生线性和角型CCs的前体。研究发现，C-PT基因在伞形科中通过串联重复事件扩增，并分化出U6PT和U8PT两种酶活性。通过氨基酸位点突变实验，研究确定了第161位氨基酸（Thr161/Ala161）是决定U6PT和U8PT活性的关键位点。这一发现揭示了C-PTs在CC结构多样性中的核心作用。
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图 4.伞形科 PTs 的系统发育分析和功能验证。
a 来自 154 个植物基因组的 PT 基因家族的系统发育，见补充图。25 了解详细的系统发育。
b 伞形科 PTs 的提取系统发育。
c HPLC 对 C-PTs 的酶活性测定。
d HPLC 对 O-PTs 进行酶活性测定。
e 伞形科 U6 和 U8PTs 之间的 6 个显着差异氨基酸位点。
f 通过 HPLC 对具有位点特异性突变的 PpPT1 和 PpPT2 进行酶活性测定。DMAPP，焦磷酸二甲基烯丙酯;DMS，去甲基亚醇聚醚。PpPT1 和 PpPT2 的
g 3-D 蛋白质结构，以及分别由 U6PT 和 U8PT 催化的伞形酮异戊二烯化的假设过程。功能变异的必需位点 （Thr161/Ala161） 以颜色显示。源数据作为源数据文件提供。
4. 伞形科环化酶起源于异位重复
环化酶是CC生物合成途径中的最后一类酶，负责催化线性和角型CCs的环化反应。系统发育分析显示，伞形科环化酶基因通过异位重复事件起源，并在伞形科的不同支系中经历了多次独立的丢失事件。这些基因在系统发育树中分为两个主要分支，分别催化线性和角型CCs的环化反应。这一发现解释了为何某些伞形科植物无法合成CCs。
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图 5.伞形科环化酶的起源和进化。
a 来自 18 个植物基因组和 17 个植物转录组的 CYP450 基因家族的系统发育，见补充图。30 用于详细的系统发育。
b 伞形科环化酶的提取系统发育。
c HPLC 对 DC 的酶活性测定。16.7 min 和 17.2 min 的峰分别为 marmesin 和 decursinol。
d HPLC 对 OC 的酶活性测定。15.4 min 和 16.0 min 的峰分别为 columbianetin 和 lomatin。源数据作为 源数据 文件提供。
5. CC生物合成途径的建立和崩溃与酶编码基因的起源和丢失有关
研究表明，CC生物合成途径的建立与C2'H、C-PT和环化酶基因的起源密切相关。这些基因通过串联重复和异位重复事件在伞形科中逐步起源，并最终完成了CC生物合成途径的建立。然而，后续的基因丢失事件导致了某些植物中CC生物合成途径的部分或完全崩溃。例如，芹菜和香菜由于丢失了所有环化酶基因，因此无法合成CCs。这一发现揭示了基因起源和丢失事件在CC生物合成途径进化中的重要作用。
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图 6.伞形科 CC 生物合成关键酶的起源和丢失总结。
伞形科 C2'Hs 至少可以追溯到 Apioideae 的共同祖先，而伞形科 C-PTs 和环化酶很可能起源于 Daucinae-Scandicinae 谱系分裂后不久。这些关键酶的后期继发性丢失很常见，更多地发生在负责角度 CC的 U8PTs 和 OCs 上。H1、C2'H;U6，U6PT;U8、U8PT。
6. CC BGC可能解释了前胡中高度积累的角CC
研究发现，前胡(P. praeruptorum)中存在一个包含C2'H、C-PT和环化酶基因的生物合成基因簇（BGC），这些基因在染色体上紧密排列。这种基因簇的存在可能促进了相关酶在转录过程中的同步性，并提高了代谢途径中中间体的转化效率，从而增强了P. praeruptorum中角型CCs的合成能力。这一发现为理解P. praeruptorum中CCs高效合成的分子机制提供了重要线索，并为其他植物中CC生物合成途径的研究提供了新的视角。
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图 7.P. praeruptorum 和 A. sinensis 中 CCs 的生物合成基因簇。
PpC2'Hs、PpPTs 和 PpOC 位于 P. praeruptorum 基因组中 9 号染色体的基因簇中，而 PpDC 位于 7 号染色体中，不属于基因簇。根据基因系统发育，可以识别涉及 PpC2'Hs 和 PpPTs 的多轮串联重复。A. sinensis 具有相似的基因簇，在 C2'H、C-PT 和圆环酶的共线基因组块中与 P. praeruptorum 相同。
✦结 论
✦
香豆素是一类具有显著药理活性的苯骈吡喃衍生物，广泛存在于多种植物中，展现出抗菌、抗炎、抗肿瘤和防凝血等功效。其结构多样，分为简单香豆素和线型、角型的呋喃/吡喃香豆素。
近年来，中国研究团队在伞形科植物中鉴定出合成复杂香豆素的关键基因，揭示了异戊烯基转移酶（PT）的功能变异是产物多样性的主要来源，并提出了线性/角型产物合成的机制模型。
此外，前胡(P. praeruptorum)中的“生物合成基因簇”为高效积累角型复杂香豆素提供了机制基础。这些发现为新型药物开发和应用拓展提供了重要依据，未来有望为人类健康和医药事业做出更大贡献。
END
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