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南京鼓楼医院分子诊疗中心
李菁、李靓、张玉婧团队
于2024年12月
在Journal of Controlled Release（IF= 10.5）
发表中药分子机制学研究
《Alleviation of colitis by honeysuckle MIR2911 via direct regulation of gut microbiota》
金银花MIR2911通过直接调节肠道菌群
缓解结肠炎
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39378978/
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引用格式：
Li W, Ding J, Chen S, Chen J, Wang C, Li J, Shi H, Yin X, Wang J, Liu J, Song H, Zhou Z, Jiang X, Jiang W, Jiang Y, Cao M, Li B, Li J, Li L, Zhang Y. Alleviation of colitis by honeysuckle MIR2911 via direct regulation of gut microbiota. J Control Release. 2024 Dec;376:123-137. doi: 10.1016/j.jconrel.2024.09.050. Epub 2024 Oct 10. PMID: 39378978.
✦ 研究结果及亮点
✦
该研究主要探讨了治疗结肠炎的中药制剂主要成分金银花MIR2911的作用机制。
确认金银花治疗结肠炎的一种新活性成分：MIR2911。
发现植物miRNA进入肠道细菌新的途径：口服金银花汤（HSD）后，肠道细菌微环境中宿主sEVs的MIR2911显着增加，并被输送到肠道细菌中。
揭示了宿主sEVs递送的植物miRNA和宿主AGO2蛋白可能是肠道细菌跨境调控的重要因素。
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图形摘要
MIR2911的图形说明可以通过靶基因调控直接调节微生物群落，以改善DSS诱导的结肠炎。
✦ 文章介绍
✦
炎症性肠病 （IBD）是一组与肠道炎症性疾病和微生物菌群失调相关的慢性复发性疾病。
使用中医 （TCM）治疗结肠炎具有副作用少的优点，但分子机制尚不清楚。最近，miRNA 已被公认为植物中的新型功能性小分子，对生物活性具有调节作用。该研究主要探讨了治疗结肠炎的中药制剂主要成分金银花MIR2911的作用机制。
结果表明，MIR2911可通过饮食吸收并在宿主细胞外小囊泡 （sEVs） 内分泌，直接作用于肠道细菌，减少埃希氏菌-志贺氏菌的丰度，并改善结肠炎症状。本研究为中医治疗的分子机制提供了新的理论基础，并确定了一种潜在的新药，治疗结肠炎的新药靶点。
✦重点摘要
✦
01
介 绍
金银花（HS）是桃花汤的主要成分，桃花汤是中国著名的治疗 IBD 和溃疡性结肠炎的草药处方。它也是韩国用于治疗 IBD 的 Bojanggunbi-tang （BGT） 的关键成分。
金银花（HS）具有抗病毒 、抗炎、抗血管生成、抗伤害性、抗癌和神经保护的效果。
02
研究结果
1. 金银花小RNA提取物对DSS诱导的结肠炎的治疗作用
以C57BL/6J小鼠为研究对象，建立葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型。研究发现金银花汤（HSD）显著减轻体重减轻、结肠缩短和炎症反应，用从HSD中提取小RNA治疗处理小鼠的促炎细胞因子 IL-1β 水平显著降低，而抗炎因子 IL-10 的水平升高。
2 . HSD MIR2911可有效改善DSS诱导的结肠炎
分析了通过 Illumina 深度测序技术获得的数据，结果显示，peu-MIR2911 在金银花 （HS） 及其汤剂（HSD）中的水平显著高于其他 miRNA（图 1）。通过合成MIR2911灌胃治疗的DSS诱导的结肠炎小鼠模型表现显著抑制了体重下降和结肠缩短，同时改善了肠壁结构损伤和免疫细胞的浸润。
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图 1.金银花汤中的 MIR2911 可有效改善 DSS 诱导的结肠炎。
（A， B）qRT-PCR筛选植物miRNAs在金银花（HS）（A）和金银花汤（HSD）（B）中的miRNA表达水平。
（C）HS和 HSD 中 MIR2911 的 Northern 印迹分析。合成MIR2911 （200 fmol） 用作阳性对照。
（D） 金银花汤 （HSD） 和金银花汤细胞外囊泡 （HS-EV） 的 qRT-PCR MIR2911 miRNA 表达水平。
（E-T）在 C57BL/6 J 小鼠 （n = 8） 中用抗 MIR2911 和 2.5% DSS 处理的 MIR2911 和 HSD-RNA。（E， M）在 C57BL/6 J 小鼠的 DSS 诱导的结肠炎模型中，MIR2911 （n = 8） 或 HS 小 RNA 与抗 MIR2911 （n = 8） 处理的图式。（F， N）体重变化百分比。（G、H、O、P）在第 9 天在处死后的指定时间测量结肠长度。（I， Q）H&E 染色的远端结肠切片。（J， R）组织学评分。结肠组织中的细胞因子表达水平。ELISA 检测 IL-1β （K， S） 和 IL-10 （L， T） 细胞因子水平。数据表明 SEM ±平均值。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
3.MIR2911 可输送到小鼠的肠道和粪细菌
通过口服给药后，使用qRT-PCR检测对MIR2911在胃肠道内的组织分布进行检测，观察到MIR2911在胃、小肠、大肠中均有荧光信号，且粪便细菌中也检测到荧光（图 2），表明MIR2911可能进入细胞。
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图 2.MIR2911被胃肠道吸收后可进入肠道细菌。
（A） C57BL/6 J 小鼠中 Cy5 标记的 MIR2911 或合成MIR2911的胃内给药示意图。
（B） 在指定时间灌胃后胃肠道中 Cy5-MIR2911 荧光分布的光学活体成像。
（C、G）在指定时间胃内施用 Cy5-MIR2911 后胃、小肠、大肠和肠道细菌的共聚焦显微镜图像。
（D-F、H）每个组织和微生物群的 Cy5 荧光强度的统计分析。
（I，J）6 小时管饲法施用 Cy5-MIR2911 后肠道细菌中 Cy5 强度的流式细胞术检测 （I） 和统计分析 （J）。施用 MIR2911 后小鼠血清 （K）、胃 （L）、小肠 （M）、结肠 （N） 和粪便 （O） 中 MIR2911 表达水平的 qRT-PCR 分析（0 小时，n = 10，其他时间， n = 6）。数据表明 SEM ±平均值。两组的数据用学生 t 检验评估，两组以上的数据用单因素方差分析评估;*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，**** P < 0.0001。
4. MIR2911通过调节肠道菌群发挥疗效
对接受MIR2911治疗的结肠炎小鼠进行肠道组织转录组测序，发现多个与炎症性肠病相关的信号通路得到改善。通过无菌小鼠实验，MIR2911未能改善无菌小鼠的结肠炎，该结果表明其可能通过调节肠道菌群来发挥改善结肠炎的疗效。(图3）
5. MIR2911对肠道微生物群落的影响
通过16S rRNA基因测序分析，发现MIR2911处理后的实验组，大肠埃希菌-志贺菌的丰度显著下降，这些细菌的变化表明MIR2911可能在减轻结肠炎症状中起到关键作用。（图3）
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图 3.MIR2911 可能通过肠道微生物群改善 DSS 诱导的结肠炎。
（A） 响应 MIR2911 结肠基因改变的火山图。（B） 使用多基因集富集分析 （GSEA） 比较 NC 处理组与 MIR2911 处理转录组。（C） NC 和 MIR2911 治疗小鼠 TGF-β 蛋白的蛋白质印迹分析。（D） NC 和 MIR2911 治疗小鼠中 TGF-β 表达水平的 qRT-PCR 分析。使用 GAPDH 作为参考对照。（E-L）MIR2911对无菌 C57BL/6 小鼠 （C57BL/6 J [GF] 小鼠） 中 DSS 诱导的结肠炎没有影响 （n = 6）。
（E） C57BL/6 J [GF] 小鼠 DSS 诱导的结肠炎模型中的 MIR2911 治疗图式。
（F） 体重变化百分比。
（G） 代表性结肠图像。
（H） 结肠长度。
（I） H&E 染色的远端结肠切片。
（J）组织学评分。
（K-L）ELISA 检测 IL-1β （K） 和 IL-10 （L） 细胞因子水平。（M-N）MIR2911 处理的 DSS 诱导的结肠炎小鼠的肠道微生物群落变化。
（M） 属水平上优势微生物的肠型分析。
（N） 用 MIR2911 胃内治疗 DSS 诱导的结肠炎后属水平粪便微生物群落的相对平均丰度。数据表明 SEM ±平均值。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
6.MIR2911主要通过外泌体封装进入粪便细菌
研究发现，口服HSD后，肠道细菌微环境中宿主 外泌体（sEVs）的MIR2911显著增加，并被输送到肠道细菌中。这一发现为植物 miRNA 进入肠道细菌提供了一条新的途径。
MIR2911进入肠道细菌的机制：利用差速离心、透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析等技术，发现MIR2911主要通过外泌体封装进入粪便细菌。（图4）
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图 4.MIR2911主要通过外泌体包膜进入粪便细菌。
（A） 从粪便细菌悬浮液 （FS-sEVs） 中分离出的小 EV 的负染色透射电子显微镜 （TEM）。
（B） FS-sEVs 大小和浓度的纳米颗粒跟踪分析 （NTA）。
（C） FS-sEVs 密度梯度分级分离的免疫印迹。以高分辨率对粗 EV 进行超速离心，将等体积的每个组分上样到 SDS-PAGE 凝胶上，并用指定的抗体印迹。
（D） q-PCR 检测宿主 sEV（来自超速离心 FS-sEV 碘克沙醇梯度的第 2-9 层）中的MIR2911水平，在胃内施用 RNase A 或 RNase A 加 Triton X-100 去污剂后 6 小时MIR2911 （n = 3）。
（E） 微生物群细胞外囊泡中管饲MIR2911的 OMV（10-12 层）和 EV（2-4 层）中 MIR2911 表达水平的 qRT-PCR 分析。
（F） 与大肠杆菌共培养 6 小时的 Caco2 细胞中 PKH67 标记的 sEVs 示意图。
（G， H） 大肠杆菌中 PKH67 标记的 Caco2 sEVs 的共聚焦显微镜图像 （G） 和流式细胞术分析 （H）。大肠杆菌核酸用 Hoechst 染色（蓝色），膜用 FM4-64 染色（红色），Caco2-sEVs 用 PKH67 染色（绿色）。图像是使用 63× 油物镜采集的。
（I） 与 sEV 一起孵育的大肠杆菌中 CD63 免疫金标记的免疫传递电子显微镜。金颗粒被描绘成块状点。比例尺，200 nm。
（J） 与大肠杆菌共培养 6 h 的 Caco2 细胞中含 Cy5-MIR2911 的 sEVs 示意图。
（K，L） 大肠杆菌中含 Cy5-MIR2911 的 sEVs 的共聚焦显微镜图像 （K） 和流式细胞术检测 （L）。对 Cy5-MIR2911 进行荧光染色 （红色）。*P < 0.05。
7. MIR2911可以通过sEV在体内从胃肠道输送给粪便细菌
构建了特异性标记肠道sEV的小鼠模型，观察到粪便细菌中绿色荧光信号增强，且含有Cy5标记的MIR2911的sEV占有一定比例。同时，Ago2蛋白在sEV组中富集，支持MIR2911的功能。（图5）
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图 5.MIR2911主要通过外泌体包膜进入粪便细菌。
（A、B）Rosa26 CAG-Loxp-stop-Loxp-CD63 的育种示意图EGFP 系列-mCherry 转基因小鼠与 Villin-cre 小鼠 （A） 和 Villin-cre-CD63EGFP-mCh 小鼠肠道中的荧光 （B）。
（C、D）Villin-cre-CD63EGFP-mCh 小鼠（包括胃、小肠和大肠）胃肠道 （C） 和粪便微生物群 （D） 的合并共聚焦显微镜图像。mCherry（红色，组织），CD63-EGFP（绿色，肠道 sEV）。
（E） Villin-cre-CD63EGFP-mCh 小鼠 FS-sEVs 中肠道 sEVs 与宿主 sEVs 比值的 ExoView 微阵列分析示意图 Cy5-MIR2911 6 小时。
（F） 使用 ExoView 技术捕获的 CD81 和 CD9 抗体捕获的 sEVs 的颗粒计数。
（G-H）饼图表示绒毛蛋白-sEVs 在宿主总 sEVs （G） 中的百分比，含 Cy5-MIR2911 的 sEVs 在宿主 sEV 总数 （H） 中的百分比。
（I） Ago2 蛋白 FS-sEVs 密度梯度分级分离的免疫印迹。
（J） 与 sEV 孵育的大肠杆菌中 Ago2 免疫金标记的免疫传递电子显微镜。金颗粒被描绘成块状点。比例尺，200 nm。
（K）含 Ago2 的 sEVs 分别占 FS-sEVs 的宿主 sEV 总数的百分比。
8. 含 MiR2911 的 sEVs 可以直接影响大肠杆菌的生长
将富含MIR2911的外泌体与大肠杆菌共培养，发现其能显著抑制大肠杆菌的生长。相比之下，直接给予合成的MIR2911对大肠杆菌生长无影响，表明MIR2911需封装于sEV中才能发挥其生物学效应。（图6）
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图 6.MIR2911 包装在 sEV 中时会影响细菌的生长。
（A） 与大肠杆菌共培养的含 NC 和 MIR2911 的 sEV 示意图 （n = 4）。
（B）.qRT-PCR 分析与大肠杆菌共培养的含 MIR2911 的 sEV。
（C） 在含 MIR2911 的 sEVs 与大肠杆菌共培养后，每小时一次，以每小时一次的吸光度 （OD 600） 监测生长情况，持续 9 小时。
（D） miRNA 或MIR2911与大肠杆菌共培养 9 小时的阴性对照示意图 （n = 3）。
（E） 与 RNaseA 共培养后 RNaseA 处理的大肠杆菌中 MIR2911 表达水平的 qRT-PCR 分析MIR2911。
（F） 大肠杆菌与 NC 和 MIR2911 的生长。
（G-O） 封装 MIR2911 的 sEVs 在灌肠给药后减轻了 DSS 诱导的结肠炎 （n = 7）。(G） 在 C57BL/6 J 小鼠 DSS 诱导的结肠炎模型中用载 sEV 的 MIR2911 进行灌肠治疗的示意图。（H） 体重变化百分比。（I） 代表性结肠图像。（J） 结肠长度。（K） H&E 染色的远端结肠切片。（L） 组织学评分。（M， N）结肠组织中的细胞因子表达水平。ELISA 检测 IL-1β （M） 和 IL-10 （N） 细胞因子水平。（O） 对含 MIR2911 sEV 灌肠治疗结肠炎组粪便中大肠杆菌 16S DNA 水平的 qRT-PCR 分析。数据显示 SEM ±平均值。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
（P）C57BL/6 J 小鼠 DSS 诱导的结肠炎模型中裸MIR2911灌肠治疗的 S 化学图。
（Q） 体重变化百分比。
（R） 代表性结肠图像。
（S） 结肠长度。
（T） H&E 染色的远端结肠切片。
（U） 组织学评分。（垂直，垂直）结肠组织中的细胞因子表达水平。ELISA 检测 IL-1β （V） 和 IL-10 （W） 细胞因子水平。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
9. 含 MIR2911 的 sEVs 可以通过直接靶向作用
通过预测和验证，确定大肠杆菌中MIR2911的靶基因为dnaG，且含有MIR2911的sEV能够下调dnaG蛋白水平，而不影响其mRNA水平。序列同源性分析显示，MIR2911的靶结合位点与埃希氏菌-志贺氏菌属的其他细菌物种高度保守，表明MIR2911可能通过调节dnaG抑制大肠杆菌-志贺氏菌的生长。（图7）
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图 7.MiR2911 通过直接调节 dnaG 抑制大肠杆菌的增殖。
（A） 大肠杆菌中 MIR2911 靶基因的 KEGG 通路富集。
（B） 用含有靶基因的 MIR2911 模拟物和荧光素酶报告基因质粒共转染的细胞中荧光素酶报告基因活性的荧光素酶报告基因测定。
（C、D）表达 dnaG-6xhis 蛋白的大肠杆菌菌株 BL21（DE3） （C） 和 NC RNA 或MIR2911的构建示意图，有或没有 sEV 包装，与表达 dnaG-His 的大肠杆菌 （D） 共培养。
（E） qRT-PCR 分析与 NC RNA 或MIR2911共培养的大肠杆菌（有或没有 sEV 包装）中 dnaG 表达水平。envR 是一种MIR2911无法靶向的基因，作为参考基因被包括在内。
（F，G）与 sEV 包装的 NC RNA 或 MIR2911 共培养后 dnaG-His 蛋白水平的蛋白质印迹分析 （H） 和 NC RNA 或 MIR2911 （I）。丽春红染色用作蛋白质上样对照。
（H） Escherichia-Shigella 属中 dnaG 序列的多序列比对。*P < 0.05，****P < 0.0001。
✦结 论
✦
总之，在治疗结肠炎，金银花miRNA提取物中的特定成分MIR2911展现出了卓越的疗效。
临床及实验研究揭示，MIR2911在缓解结肠炎症状、修复肠壁结构损伤以及调控免疫细胞浸润方面发挥着重要作用。此外，该成分通过调整肠道微生物组成，尤其是降低大肠埃希菌-志贺菌属的相对丰度，从而发挥其治疗作用。进一步的机制探究发现，MIR2911主要通过被宿主细胞外小泡（sEVs）包裹的方式，进入肠道细菌内部，并在此过程中抑制大肠杆菌的生长。MIR2911的靶基因为dnaG，其通过减少该基因编码蛋白的表达量，而不影响其mRNA水平，实现对细菌生长的调控。
这些发现不仅为MIR2911作为结肠炎治疗手段的应用提供了坚实的科学依据，也为开发新的治疗策略和药物靶点指明了方向。
END
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