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西南交通大学医学院鲁雄教授、谢超鸣研究员
和成都市第三人民医院郭小川团队
于2024年11月7日
在Bioact Mater（IF=18.0）
发表中医学临床研究结果
电针结合导电多酚微针可加速伤口愈合并缓解糖尿病抑郁样行为
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X24004857?via%3Dihub#abs0020
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引用格式：
Hou Y, Guo X, Ran J, Lu X, Xie C. Conductive polyphenol microneedles coupled with electroacupuncture to accelerate wound healing and alleviate depressive-like behaviors in diabetes. Bioact Mater. 2024 Nov 7;44:516-530. doi: 10.1016/j.bioactmat.2024.11.001. PMID: 39584064; PMCID: PMC11583732.
【研究结果及亮点】
导电多酚微针可调节局部免疫微环境。
电针大椎穴(GV14) 抑制全身炎症。
电针微针可加速糖尿病大鼠的伤口愈合。
这种干预策略促进伤口愈合并缓解与炎症相关的抑郁症。
研究介绍
图形摘要
该研究介绍了一种治疗方法：电针 (EA) 刺激大椎穴 (GV14) 与多酚介导的导电水凝胶微针相结合的方法，以促进糖尿病伤口愈合。
在大椎穴处施加电刺激能够抑制全身炎症，而导电多酚水凝胶微针与电刺激相结合，可长期调节伤口的局部免疫微环境。通过破坏炎症-抑郁循环，这种方法有效地促进了糖尿病伤口的愈合。
什么是导电水凝胶微针？
导电水凝胶微针主要由甲基丙烯酰基化明胶 (GelMA)、聚多巴胺修饰的聚（3,4-乙烯二氧噻吩）纳米粒子 (PPEDOT)、多巴胺（DA）和枸杞多糖 (LBP) 组成，协同电针刺激大椎穴，以促进糖尿病伤口愈合。通过以下方式取得了良好的治疗效果。
实验部分（简要）
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制备导电微针：通过结合甲基丙烯酰化明胶（GelMA）、多巴胺修饰的聚(3,4-乙二氧噻吩)（PPEDOT）、多巴胺（DA）和枸杞多糖（LBP）制备了导电水凝胶微针。
体外细胞相容性测试：使用L929小鼠成纤维细胞评估了微针的细胞相容性，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察细胞生长情况，并用MTT实验量化细胞活性。
电刺激下的细胞培养：在电刺激条件下培养L929细胞和RSC96大鼠雪旺细胞，评估电刺激对细胞增殖和分化的影响，并测量胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）水平。
抗氧化能力测试：利用RAW 264.7细胞评估微针的抗氧化能力，通过DCFH-DA染色分析活性氧（ROS）的清除能力。
巨噬细胞极化：在不同水凝胶上培养RAW 264.7巨噬细胞，通过免疫荧光染色评估M1型和M2型巨噬细胞的极化状态。
实时定量PCR（qPCR）：检测RAW264.7细胞中TNF-α和IL-10基因的表达，以评估巨噬细胞的炎症反应。
糖尿病大鼠模型建立：通过注射链脲佐菌素（STZ）建立II型糖尿病大鼠模型，并在背部制造全层皮肤伤口。
全身炎症抑制实验：将糖尿病大鼠分为三组，分别进行电针刺激、伤口区域电刺激和对照组，评估电针对全身炎症的影响。
局部炎症抑制实验：在非电刺激和电刺激条件下，将不同组成的水凝胶微针应用于大鼠背部的四个伤口，评估局部炎症反应。
行为测试：对不同处理组的糖尿病大鼠进行开放场测试和尾悬挂测试，以评估抑郁样行为。
糖尿病伤口愈合评估：记录不同处理组大鼠伤口的愈合情况，并计算伤口闭合百分比。
RNA测序和数据分析：对接受不同处理的糖尿病大鼠皮肤组织样本进行RNA测序，以探究电针和微针治疗的分子机制。
定量实时PCR（qPCR）：对糖尿病大鼠伤口皮肤组织中的P38MAPK、PI3K、AKT和FOXP3基因表达进行定量分析。
其中，全身炎症抑制实验详细步骤如下：
实验中使用的是糖尿病大鼠模型，这些大鼠被随机分为三个不同的实验组：
第一组（EA(GV14)组）：接受电针刺激大椎穴（GV14）。
第二组（EA(Wound)组）：接受电针刺激伤口区域。
第三组（对照组）：不接受任何额外处理。
电针刺激：
在创建全层皮肤缺陷后的前三天，每天对大鼠进行一次电针刺激，每次持续20分钟。
刺激后，根据实验组的不同，分别对GV14穴位或伤口区域施加电针刺激。
样本收集：
在电针刺激结束后的第七天，从大鼠心脏收集血液样本，并通过离心分离出血清。
炎症因子测定：
使用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒测定血清中去甲肾上腺素（norepinephrine）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平。
图 1.水凝胶微针制备和伤口修复机制的示意图。（A） 水凝胶微针的制备。（B） 水凝胶微针与 EA 在 GV14 处联合治疗和增强糖尿病大鼠皮肤伤口修复的协同机制。
研究结果
设计策略的有效性：
结果表明，通过电针刺激GV14穴位与导电水凝胶微针的结合使用，能够有效抑制全身炎症、调节局部免疫反应，并促进糖尿病伤口组织和周围神经的修复。
导电纳米粒子和水凝胶微针的特性：
我们利用GelMA、PPEDOT、DA和LBP这四种材料，通过光引发技术成功制造出了一种新型的导电水凝胶微针。这种微针的特别之处在于，它的背面因为加入了PPEDOT而具备了导电性能。
特点1：长时间抗氧化（90分钟）
微针还表现出显著的长时间抗氧化能力，能够有效清除自由基，并且在电刺激下恢复其抗氧化能力。
特点2：药物释放能力
吸水膨胀不溶解，能够传递药物。
其吸水速度快，30分钟就能吸足水分，大约1小时就能膨胀到稳定状态。其特点为能缓慢、持续（12小时）地释放枸杞多糖（LBP），加速伤口愈合。
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图 2.导电纳米颗粒和水凝胶微针的物理化学性质的表征。（A） PPEDOT 的 SEM 图像。（B） 有和没有 DA 修饰的纳米颗粒分散的数字图像。（C） PPEDOT 的 XPS 分析。（D） 水凝胶微针阵列的数字图像。（E） 水凝胶微针的 SEM 图像。（F） DA-LBP-PPEDOT-GelMA 的压缩试验，左上角显示台盼蓝染色的穿刺大鼠皮肤的数字图像。（G） 水凝胶微针的电导率。（H） 与 DPPH 自由基反应 90 分钟后分析的各种水凝胶微针的紫外光谱。（I） 水凝胶微针的 DPPH 清除能力。（J） 在自由基清除能力耗尽后通过电刺激恢复 DPPH 自由基清除效率（重复清除 DPPH 自由基）。（K） 水凝胶微针中 LBP 的释放。
细胞相容性、抗氧化和免疫调节特性：
在体外细胞实验中，导电水凝胶微针显示出良好的细胞相容性，促进了L929细胞的增殖。免疫调节实验显示，微针能够调节巨噬细胞从M1型向M2型的极化，减少炎症因子的表达，并增加抗炎因子的表达。
糖尿病伤口和周围神经修复：
实验结果表明，电针与导电微针的联合使用显著提高了糖尿病伤口的愈合率，并且通过免疫荧光染色显示，该治疗方法促进了伤口附近神经的再生。
抑郁样行为的缓解：
行为测试结果表明，电针与导电微针的联合使用能够显著缓解糖尿病大鼠的抑郁样行为，这通过开放场测试和尾悬挂测试得到证实。此外，治疗组大鼠血清中5-HT和FOXP3水平的显著增加进一步支持了治疗效果。
炎症和抑郁的调节途径：
RNA测序分析揭示了电针和导电微针通过调节P38MAPK、PI3K-AKT和FOXP3信号通路来促进伤口修复和缓解抑郁样行为的分子机制。
值得注意的是，电针刺激大椎穴（GV14）穴位抑制了全身炎症，而导电微针提供了局部电刺激以控制局部炎症，两者协同作用打破了炎症和抑郁之间的恶性循环。
电针辅助水凝胶微针的糖尿病伤口愈合机制：
电针激活迷走-肾上腺轴抑制全身炎症，而导电微针提供局部电刺激以控制局部炎症，两者协同作用打破了炎症和抑郁之间的恶性循环，促进了糖尿病伤口的愈合。
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图 3.水凝胶微针的细胞相容性和免疫调节特性。（A） 在不同水凝胶上培养 1 或 3 天的 L929 细胞的共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 图像。绿色表示活细胞;红色表示死细胞。（B） L929 细胞在不同水凝胶上增殖 1 或 3 天。（C） 细胞电刺激示意图。（D） 在不同水凝胶上培养的第 3 天不同处理的雪旺细胞的 CLSM 图像。蓝色 （DAPI） 表示细胞核;红色（鬼笔环肽）表示 F-肌动蛋白。（E） 在不同水凝胶上培养的巨噬细胞中 ROS 的 CLSM 图像。（女、G）在不同水凝胶上培养的 RAW 264.7 巨噬细胞中 M1 相关标志物 TNF-α （F） 和 M2 相关标志物 IL-10 （G） 的表达水平。（H） 在不同水凝胶上培养的 iNOS 和 CD163 表达以及 RAW 264.7 巨噬细胞核染色的荧光显微镜检查。（I） iNOS 和 CD163 荧光强度的定量。
图 4.GV14 的 EA 和水凝胶微针在糖尿病伤口修复中的协同作用。（A） 组织和周围神经修复示意图。（B） 在指定时间段内用不同水凝胶治疗的伤口的数字图像。（C） 在指定时间点不同治疗组的伤口面积大小。（D） 愈合 21 天后每组代表性伤口切片的 H&E 染色。（E） 21 天后每组肉芽组织间隙的长度。（女、G）21 天后每组 MBP （F） 和 PGP-9.5 （G） 的免疫荧光染色图像。蓝色 （DAPI） 表示细胞核;红色表示 MBP 和 PGP-9.5。（H， I）MBP （H） 和 PGP-9.5 （I） 免疫荧光图像的相对荧光面积。
图 5.GV14 电针和水凝胶微针缓解糖尿病伤口 SD 大鼠的抑郁样行为。（A） 旷场试验 （OFT）：示意图 （I）;大鼠在四组中的运动轨迹 （II;组由 III 中所示的彩色条表示）;以及 OFT 期间在中央区和外围区花费的时间比率 （III）。（B） 尾部悬架测试中挣扎（不动）的时间比例。（C、D）每组 5-HT （C） 和 FOXP3 （D） 的血清浓度。（E） 全身和局部炎症调节的示意图。（F） 每组去甲肾上腺素的血清浓度。（G） 每组脾脏中乙酰胆碱的浓度。（H） 每组 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的血清浓度。（I） 7 天后每组创面部位 IL-6 和 TNF-α 的代表性免疫荧光染色图像。蓝色 （DAPI） 表示细胞核;红色表示 IL-6 和 TNF-α。（J） IL-6 和 TNF-α 免疫荧光染色的相对荧光面积。
图 6.DEGs 的 RNA 测序分析以及与 GV14 和水凝胶微针的 EA 相关的调节途径。（A） 维恩图说明了各种治疗比较中 DEG 的数量。（B） DA-LBP-PPEDOT-GelMA （EA） 和 DA-LBP-PPEDOT-GelMA 处理之间基因表达差异的火山图。（C） 根据 BP、CC 和 MF 对 DEGs 进行 GO 分类。（D） 基于差异基因表达的富集 KEGG 通路。（E） DEGs 的热图分析。（F） 示意图描述了 GV14 的 EA 和水凝胶微针对促进糖尿病伤口周围神经和组织再生以及减轻大鼠抑郁样行为的综合影响。
结论
本研究开发了一种干预措施，该措施利用电针刺激大椎（GV14）穴位与DA-LBP-PPEDOT-GelMA导电水凝胶微针相结合。这种方法有效地抑制了全身和局部炎症，建立了一个良性循环，促进了糖尿病伤口组织和周围神经的修复，并缓解了大鼠的抑郁样行为。
这种结合了电针和多酚介导的抗炎和抗氧化效果的策略，为临床糖尿病伤口管理提供了新的视角，通过打断炎症-抑郁循环，促进糖尿病伤口的愈合。
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