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南京中医药大学杨烨、顾春艳教授
药学院李念光教授
上海市静安区闸北中心医院周帆教授团队
于2024年11月28日
在Advanced Science（IF=14.3）
发表中药学研究结果
《PNPO-Mediated Oxidation of DVL3 Promotes Multiple Myeloma Malignancy and Osteoclastogenesis by Activating the Wnt/β-Catenin Pathway》
PNPO介导的DVL3氧化促进多发性骨髓瘤恶性进展和成骨细胞生成，通过激活Wnt/β-连环蛋白途径。
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202407681?msockid=1594db0cba19606f1db8c8ebbb3261e2
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引用格式：
Deng Z, Sun S, Zhou N, Peng Y, Cheng L, Yu X, Yuan Y, Guo M, Xu M, Cheng Y, Zhou F, Li N, Yang Y, Gu C. PNPO-Mediated Oxidation of DVL3 Promotes Multiple Myeloma Malignancy and Osteoclastogenesis by Activating the Wnt/β-Catenin Pathway. Adv Sci (Weinh). 2024 Dec 10:e2407681. doi: 10.1002/advs.202407681. Epub ahead of print. PMID: 39656865.
【名词解释】
PNPO（Pyridoxine 5'-phosphate oxidase，吡哆醇-5'-磷酸氧化酶）是一种关键酶，负责将吡哆醇和吡哆胺的磷酸形式转化为活性形式吡哆醛5'-磷酸（PLP），这是维生素B6的活性形式，对多种代谢过程至关重要。PNPO基因位于染色体17q21.3215，其表达与某些癌症的发展相关，包括多发性骨髓瘤、乳腺癌和卵巢癌。
艾曲泊帕（Eltrombopag）是一种血小板生成素受体激动剂，主要用于治疗与血小板相关的疾病。
【研究结果及亮点】
本研究旨在确定雷公藤红素的具体靶点，并为 多发性骨髓瘤（MM）开发更有效、毒性更小的治疗方案。雷公藤红素用作探针来确定其特定靶点吡哆醇-5'-磷酸氧化酶 (PNPO)。
该研究强调了 PNPO 作为高危基因在多发性骨髓瘤（MM）发展中的重要性，并表明艾曲波帕可能是一种有前途的治疗选择。
研究介绍
多发性骨髓瘤（MM）是一种起源于骨髓的浆细胞癌症，其发展受骨髓环境的影响。
雷公藤红素（Celastrol），一种从中药雷公藤中提取的天然化合物，已显示出对多种癌症，包括MM的抗癌效果。本研究旨在鉴定雷公藤红素的特定靶点，并开发更有效、毒性更低的MM治疗方案。
研究者通过使用雷公藤红素作为探针，确定了PNPO为MM细胞增殖和骨损伤的潜在靶点。
雷公藤红素（Celastrol）在本次研究中有什么作用?
作为探针筛选靶点：
雷公藤红素被用作探针，通过荧光标记和微阵列分析，筛选出PNPO作为多发性骨髓瘤细胞增殖和骨损伤的潜在靶点。
实验部分（简要）
研究结果
1、PNPO与多发性骨髓瘤（MM）预后的相关性：
研究发现，PNPO在多发性骨髓瘤患者中的表达水平显著升高，并且与患者预后不良相关。
具体来说，PNPO的高表达与多个患者队列中较差的总生存率（OS）相关，同时在有骨病变的患者中PNPO表达水平更高。（图1）
我们的分析揭示了 45 种蛋白质对雷公藤红素具有较高的结合亲和力（图1A ）。
此外，MST 分析证实了雷公藤红素和 PNPO 之间存在直接相互作用（图1H ）。
2、PNPO对MM细胞增殖的影响：
实验显示，PNPO的过表达显著促进了多发性骨髓瘤细胞的增殖，而PNPO的敲减则降低了细胞生长率。在细胞周期分析中，PNPO过表达的细胞中有更多的细胞处于G2/M期，而敲减PNPO则增加了细胞凋亡。 （图2）
3、PNPO促进破骨细胞分化：
研究还发现，PNPO通过外泌体促进破骨细胞的分化，加剧了多发性骨髓瘤患者的骨损伤。在动物模型中，PNPO的过表达增加了骨密度和体积的损失，表明PNPO在骨损伤中起着重要作用。 （图3）
4、PNPO激活Wnt/β-连环蛋白途径：
机制上，PNPO通过氧化DVL3的M282位点，导致Wnt/β-连环蛋白途径的异常激活。PNPO的氧化功能在DVL3与GSK3β的结合中起关键作用，影响β-连环蛋白的稳定性和后续信号传导。 （图4）
5、艾曲泊帕（eltrombopag）作为潜在治疗药物：
通过结构基础的药物筛选，研究团队发现艾曲泊帕（eltrombopag）能够靶向PNPO，并抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖和破骨细胞分化。艾曲泊帕（eltrombopag）通过阻断PNPO与DVL3的相互作用，减少了β-连环蛋白的表达，并抑制了多发性骨髓瘤细胞的生长。 （图5）
6、艾曲泊帕（eltrombopag）的体内效果：
在多种动物模型中，艾曲泊帕（eltrombopag）显著延长了多发性骨髓瘤模型小鼠的生存时间，并减少了骨损伤。艾曲泊帕（eltrombopag）治疗显著抑制了多发性骨髓瘤细胞的增殖，减少了肿瘤的生长。 （图6）
7、艾曲泊帕（eltrombopag）的临床效果：
初步的临床试验显示，接受艾曲泊帕（eltrombopag）治疗的多发性骨髓瘤患者中，有客观反应率的提高，包括完全反应和部分反应。艾曲泊帕（eltrombopag）治疗与较长的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）相关。 （图7）
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图1 PNPO 是预后不良的高危指标，并促进 MM 细胞增殖。
A) HuProt 20K 蛋白质组微阵列芯片揭示了与雷公藤红素结合的前 5 个蛋白质靶点。红色箭头表示与雷公藤红素结合的阳性蛋白，蓝色箭头表示阴性对照。B) GSE5900 数据集中的 MM 患者中 PNPO mRNA 水平显着增加。y轴显示 PNPO 水平， x轴显示 NP ( n = 22)、MGUS ( n = 44) 和 MM ( n = 351) 患者。C–E) TT2 C)、APEX D) 和 GSE136337 E) 数据集中的 MM 患者中 PNPO mRNA 表达增加与较差的总生存期 (OS) 呈正相关。F) GSE6401 数据集中骨病变患者的 PNPO mRNA 水平较高。G) 原代 MM ( n = 20) 和 NP ( n = 10) 样本的代表性 IHC 染色，以及 NP 和 MM 组之间 PNPO IHC 染色强度的统计分析。H) PNPO蛋白与雷公藤红醇相互作用的MST分析。I) WB 检查了 EV 和 PNPO-OE ARP1 和 H929 细胞中的 PNPO 表达，CCK8 检测显示 PNPO-OE MM 细胞比 EV MM 细胞具有更高的增殖能力 ( n = 5)。J) EV 和 PNPO-OE 细胞的细胞周期分析 ( n = 3)。K) WB检测了Ctrl和PNPO-KD MM细胞中的PNPO表达，CCK8检测显示PNPO-KD MM细胞的增殖能力较Ctrl细胞弱( n = 5)。L) Ctrl 和 PNPO-KD 细胞的细胞凋亡分析 ( n = 3)。M) H929 Ctrl 和 PNPO-KD 异种移植 NOD-SCID 小鼠中肿瘤生长的时间过程（ n = 5）。N) 取自 NOD-SCID 小鼠的 H929 Ctrl 和 PNPO-KD 异种移植物的肿瘤重量 ( n = 5)。O) 建立降植烷诱导小鼠模型的示意图。P) WB 检测到脾组织中 HA 标签的表达。Q) 吉姆萨染色显示腹水细胞呈浆细胞样外观。R) 流式细胞术显示腹水细胞普遍表达 CD138，这是浆细胞的标志物。S) PNPO 过度表达降低了降植烷诱导模型小鼠的存活率 ( n = 18)。数据表示为平均值±标准差。*** p < 0.001。条形代表 200 (G) 和 25 µm (Q)。
图2 PNPO 通过外泌体促进破骨细胞分化。
图3 PNPO 通过激活 MM 中的 Wnt/β-catenin 通路影响细胞增殖和破骨细胞分化。
图4 PNPO 氧化 DVL3 的 M282 位点，导致 β-连环蛋白激活。
图5 艾曲波帕以 PNPO 为靶点并抑制骨髓瘤的进展。
图6 艾曲波帕在体内抑制骨髓瘤细胞的增殖和破骨细胞的分化。
图7 艾曲波帕可有效抑制 PDX 小鼠模型和 MM 患者的肿瘤生长。
总结
艾曲泊帕抑制了多发性骨髓瘤（MM）细胞的生长，并通过破坏PNPO和DVL3之间的相互作用减少了骨病变，这一点得到了初步临床试验的支持。
该研究强调了PNPO作为一个高风险基因在多发性骨髓瘤发展中的重要性，并表明艾曲泊帕可能是一种有前景的治疗选择。
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