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广东省中医院蔡业峰、
香港理工大学李晓晓团队
于2024年11月12日
在Phytomedicine（IF=6.7）
发表中药学研究结果
《Huang-Lian-Jie-Du decoction alleviates cognitive impairment in high-fat diet-induced obese mice via Trem2/Dap12/Syk pathway》
黄连解毒汤通过Trem2/Dap12/Syk通路改善高脂饮食诱导小鼠的认知障碍
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S094471132400905X?via%3Dihub
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引用格式：
Zheng JY, Pang RK, Ye JH, Su S, Shi J, Qiu YH, Pan HF, Zheng RY, Hu XR, Deng QW, Li XX, Cai YF, Zhang SJ. Huang-Lian-Jie-Du decoction alleviates cognitive impairment in high-fat diet-induced obese mice via Trem2/Dap12/Syk pathway. Phytomedicine. 2024 Dec;135:156248. doi: 10.1016/j.phymed.2024.156248. Epub 2024 Nov 12. PMID: 39556986.
【研究结果及亮点】
黄连解毒汤（HLJD）能够通过降低高脂饮食诱导的肥胖小鼠海马区内的Aβ42和Tau蛋白水平、缓解神经炎症以及抑制小胶质细胞的激活，从而改善模型小鼠的认知障碍行为表现。
涉及调控小胶质细胞的通路：Trem2/Dap12/Syk信号通路。
研究介绍
肥胖已成为全球性的健康挑战，与认知功能障碍密切相关。长期高脂饮食会导致动物脑内神经炎症、Aβ斑块积累和小胶质细胞活化等神经系统病理变化，这些变化与认知障碍的发生密切相关。
黄连解毒汤（HLJD）是一个中药方剂，具有清热解毒的作用，常用于治疗三焦火毒热盛证。
现代研究表明，HLJD在治疗阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病方面具有潜在疗效，具有抗神经炎症、抗氧化应激、抑制小胶质细胞活化、减少Aβ斑块聚集和缓解脑内胰岛素抵抗等效果。
探讨黄连解毒汤是否能够改善高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠的认知功能障碍，并研究其潜在机制，特别是炎症因子和Trem2/Dap12/Syk信号通路在其中的作用。
研究方法
动物实验设计
使用雄性C57/BL6小鼠，分为四组，每组8只：
正常对照组（NC-V）
高脂饮食组（HFD-V）
高脂饮食+低剂量黄连解毒汤组（HFD-HLJD-L）
高脂饮食+高剂量黄连解毒汤组（HFD-HLJD-H）。
干预：正常对照组接受标准饮食，而高脂饮食组接受60%脂肪的高脂饮食16周。从第9周开始，HLJD组的小鼠每天通过灌胃给予不同剂量的HLJD（4 g/kg或8 g/kg），持续8周。
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行为测试
旷场实验（OFT）：评估小鼠的活动水平和焦虑行为，记录总行程距离和速度。
高架十字迷宫实验（EPM）：测量小鼠的焦虑行为，记录在开放臂和封闭臂的停留时间和进入次数。
新物体识别实验（NOR）：评估小鼠的记忆和识别能力，观察其对新物体的探索时间。
Morris水迷宫实验（MWM）：测试小鼠的空间记忆能力，记录其找到隐藏平台的时间和在目标象限的停留时间。
生物标志物检测
蛋白质表达检测：通过免疫荧光和Western blot技术检测小鼠海马中Aβ42、Tau、Trem2、Dap12、p-Syk等蛋白的表达水平。
基因表达检测：利用qPCR方法检测与炎症和Trem2/Dap12/Syk信号通路相关的基因mRNA表达水平。
分子对接分析
化合物与蛋白相互作用预测：使用分子对接软件预测HLJD中的化学成分与人TREM2、DAP12和SYK蛋白的结合能力，分析其潜在的相互作用机制。
细胞实验
BV2细胞培养与处理：培养小鼠微胶质细胞系BV2，用不同浓度的HLJD和柠檬素处理细胞24小时。
细胞活性检测：使用CCK8试剂盒检测细胞的存活率。
基因与蛋白表达检测：通过qPCR和Western blot检测BV2细胞中Trem2、Dap12和p-Syk的表达水平。
研究结果
改善认知障碍：
黄连解毒汤（HLJD）显著减少了高脂饮食（HFD）小鼠的Aβ42和Tau蛋白在海马区的积累，改善了认知障碍。
缓解神经炎症：
黄连解毒汤能够降低海马区的炎症因子表达，如Il6、Il1β和Il10，从而缓解神经炎症。
抑制小胶质细胞激活：
黄连解毒汤通过抑制Trem2/Dap12/Syk信号通路，减少小胶质细胞的激活，进而降低了炎症反应和神经损伤。
分子对接分析：
柠檬苦素作为黄连解毒汤中的重要成分，能够与TREM2、DAP12和SYK良好结合，或许是其发挥药效的关键。
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动物行为测试结果
旷场实验（OFT）图1：HFD小鼠的总行程距离和速度显著低于正常对照组，表明其活动能力下降。HLJD治疗显著提高了HFD小鼠的总行程距离和速度，其中高剂量HLJD还增加了中央区域停留时间，说明HLJD能改善小鼠的活动能力和焦虑行为。
图1 黄连解毒汤改善HFD诱导的肥胖小鼠的活跃度
高架十字迷宫实验（EPM）图2：HFD小鼠在开放臂的停留时间和进入次数显著减少，表现出焦虑行为。HLJD治疗显著增加了HFD小鼠在开放臂的停留时间和进入次数，表明其能缓解小鼠的焦虑行为。
图2 HLJD改善HFD诱导的肥胖小鼠的情志异常
新物体识别实验（NOR）图3：HFD小鼠对新物体的探索时间与正常对照组相比无显著差异，但有减少的趋势，提示其认知功能受损。HLJD治疗对小鼠的新物体识别能力有一定改善作用，但未达到统计学显著性。
图3 HLJD改善HFD诱导的肥胖小鼠的认知功能
Morris水迷宫实验（MWM）图4：HFD小鼠在寻找隐藏平台时的潜伏期显著延长，在目标象限的停留时间显著减少，表明其空间记忆能力受损。HLJD治疗显著缩短了HFD小鼠的潜伏期，并增加了其在目标象限的停留时间，说明HLJD能有效改善小鼠的空间记忆能力。
图4 HLJD改善HFD诱导的肥胖小鼠的认知功能
生物标志物检测结果
蛋白质表达检测：HFD小鼠海马中Aβ42和Tau蛋白的阳性细胞密度显著高于正常对照组，提示Aβ和Tau在HFD小鼠海马中积累。HLJD治疗显著降低了Aβ42和Tau阳性细胞的密度，表明其能减少Aβ和Tau在海马中的沉积。
图5 HLJD有效降低HFD诱导的肥胖小鼠海马体中Aβ42和总Tau水平
基因表达检测：HFD小鼠海马中炎症相关基因Il6、Il1b、Il10的mRNA表达水平显著升高，而Tnf、Trem2、Dap12、Csf1r的表达虽有上升趋势，但未达到统计学显著性。HLJD治疗显著降低了Il6、Il1b、Il10的基因表达，并使Tnf、Trem2、Dap12、Csf1r的表达呈现下降趋势，说明HLJD能抑制海马中的神经炎症反应，并可能调节Trem2/Dap12信号通路。
图6 HLJD有效降低HFD诱导肥胖小鼠海马体组织中炎症相关及Trem2/Dap12/Syk通路相关标志物的表达水平
Trem2/Dap12/Syk信号通路检测结果
蛋白表达检测：HFD小鼠海马中Trem2、Dap12的蛋白表达以及p-Syk/Syk比值显著高于正常对照组，提示Trem2/Dap12/Syk信号通路在HFD小鼠中被激活。HLJD治疗显著降低了Trem2、Dap12的蛋白表达和p-Syk/Syk比值，表明其能抑制该信号通路的激活。
图7 HLJD有效降低HFD诱导的肥胖小鼠海马体中小胶质细胞上Trem2/Dap12/Syk通路的表达
免疫荧光检测：在海马小胶质细胞中，HFD小鼠的Trem2、Dap12、p-Syk表达水平显著升高，而HLJD治疗能显著降低这些蛋白在小胶质细胞中的表达，进一步证实HLJD对Trem2/Dap12/Syk信号通路的抑制作用主要发生在小胶质细胞中。
分子对接分析结果
在HLJD中鉴定出的22种化学成分中，柠檬素（Limonin）与TREM2、DAP12、SYK的结合能最低（分别为-7.32、-6.22、-8.38 kcal/mol），显示出良好的结合能力。其他如Canadine、Cavidine、Berlambine等成分也与这些蛋白有一定的结合能力，提示HLJD中的多种成分可能通过与TREM2、DAP12、SYK结合来发挥作用。
图8 HLJD中化学成分与人TREM2、DAP12和SYK的分子对接结果
细胞实验结果
细胞活性检测：HLJD和柠檬苦素（Limonin）在48小时内对BV2细胞的存活率无显著影响，表明其在实验浓度下对细胞无毒性。
基因与蛋白表达检测：HLJD和柠檬苦素能显著抑制BV2细胞中Trem2和Dap12的mRNA表达，并呈剂量依赖性。HLJD在25和50 µg/mL浓度下显著降低了BV2细胞中Trem2、Dap12和p-Syk的蛋白水平，而25和50 µM的柠檬素也显示出降低这些蛋白表达的趋势，说明HLJD和柠檬素在体外也能抑制Trem2/Dap12/Syk信号通路的激活。
图9 HLJD和Limonin(柠檬苦素)可抑制小胶质细胞(BV2)中Trem2/Dap12/Syk通路
总结
本研究证实黄连解毒汤（HLJD）能够通过降低高脂饮食诱导的肥胖小鼠海马区内的Aβ42和Tau蛋白水平、缓解神经炎症以及抑制小胶质细胞的激活，从而改善模型小鼠的认知障碍行为表现。
其作用机制可能与HLJD调控小胶质细胞中的Trem2/Dap12/Syk信号通路的表达有关。这一研究为临床上使用HLJD治疗认知障碍提供了科学依据，并为开发新的认知障碍治疗药物提供了重要的思路。
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