真菌感染的临床现状与临床意义
侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD）是指真菌侵入人体，在组织、器官或血液中繁殖、生长，并导致炎症反应及组织损伤的感染性疾病。近年来，随着临床诊疗方案日趋复杂，各种侵入性操作、广谱抗生素、免疫抑制剂、糖皮质激素以及肿瘤化疗药物的广泛使用，该病发生率逐年升高，已是血液、感染、呼吸、重症监护等多个相关临床科室共同面临的难题，而在这之中，肺部真菌病的危害性较大，也最为常见。据国家呼吸道疾病临床研究中心研究数据表明[1]，住院患者与门诊患者肺部真菌感染的比例逐年上升，分别从2013年的26.5/1000人和3.07/1000人上升为2019年的46.2/1000人和8.48/1000人，其中肺曲霉病发病率为24.47 ‰，肺隐球菌病发病率为6.84 ‰，肺孢子菌肺炎发病率为0.93 ‰，其他肺真菌病发病率为8.35‰（图1）。
图1. 门诊与住院患者的2013-2019肺部真菌病发病情况的变化曲线及相关感染的发生率[1]
真菌疾病常见病原菌特点及治疗
流行病学资料显示，曲霉菌属、新型隐球菌和耶氏肺孢子菌这三种真菌在我国的侵袭性肺真菌病中较为常见，而这三种真菌的治疗方法也各不相同（见表1）。
表1. 曲霉菌属、新型隐球菌和耶氏肺孢子菌的治疗方法简介
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真菌感染的实验室检查
侵袭性真菌病起病隐匿且临床症状不典型，早期诊断困难，对于艾滋病患者[2]、干细胞或器官移植患者、免疫抑制剂及糖皮质激素使用人群、血液病及肿瘤疾病患者等真菌疾病易感人群而言，真菌感染的早期诊断对于患者及时接受治疗至关重要。目前的临床实验室中，常规的真菌检查主要包括病原学（涂片染色找真菌、真菌培养）和血清学（G试验、GM试验）等。近年来国内外针对侵袭性真菌病的临床诊疗指南或共识指出[3-5]，对侵袭性真菌病的诊断除了依靠适宜的微生物学、组织病理学、影像学等方法外，2020年欧洲癌症研究和治疗组织（EORTC）和真菌病研究组教育研究协会（MSGERC）还强调了分子生物学诊断的价值和意义[6]。
微生物学检查
真菌的直接镜检操作简便，适用于多种临床样本（支气管肺泡灌洗液、痰液、尿、粪、分泌物、脑脊液、引流液等），可快速报告结果，具有重要的临床价值，但敏感性不高，依赖检验人员的经验，无法区分菌群来源。
真菌培养是真菌感染的重要诊断方法，对于诊断感染及确认致病菌种类都有重要的价值。培养出的真菌还能进行体外药敏检测，指导临床用药。但这一方法存在耗时较长、阳性率低、敏感度低、难以区分定植菌与感染菌的问题。而培养阳性的结果还需要工作人员判断是致病菌还是污染菌。
图2. 真菌培养与鉴定图示
血清学检查
血清学的抗原检查适用于侵袭性真菌病的早期诊断，耗时短，结果报告迅速，是传统真菌学检查的重要补充。临床较为常用的检测方法为：隐球菌荚膜抗原检测、曲霉半乳甘露聚糖抗原检测（GM试验）和真菌1,3-β-D葡聚糖检测（G试验）。其中隐球菌荚膜抗原检测用于隐球菌感染患者的辅助诊断，GM实验适用于怀疑侵袭性曲霉感染的患者，G实验可用于怀疑侵袭性真菌病（包括念珠菌病、曲霉病、肺孢子菌病等，不包括隐球菌病、毛霉病等）的患者。血清学的检测结果影响因素多、重复性差，仅有少数真菌有相应的检查方法，并不能覆盖所有的致病真菌。
图3. GM试验、G试验原理图示
分子生物学检测
传统的病原学方法敏感度低，血清学检测方法无法覆盖所有的致病菌，且影响因素多，重复性差，相比之下分子生物学的方法检测周期短、灵敏度高、可鉴定到属/种、结果影响因素少、结果判读简单，能在较短的时间内检测到含量很低的真菌DNA，有利于真菌感染的早期诊断的特点。通过选取曲霉菌属18s rRNA 基因、新型隐球菌ITS 基因和耶氏肺孢子菌mtLSUrRNA 基因中保守的区域设计特异性引物和探针，在样本DNA纯化之后采用荧光PCR 对DNA 进行检测。荧光定量PCR 仪器根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，并计算出样本Ct 值。曲霉菌属18s rRNA 基因Ct≤33.7，则曲霉菌属阳性；新型隐球菌ITS 基因Ct≤36，则新型隐球菌阳性；耶氏肺孢子菌mtLSUrRNA 基因Ct≤36，则耶氏肺孢子菌阳性。
图4. 曲霉菌属18s rRNA 基因、新型隐球菌ITS 基因和耶氏肺孢子菌mtLSUrRNA 基因荧光PCR检测图示
中山医院检验科利用多重实时荧光定量PCR技术高灵敏度、高特异性的特点，使用三种不同的荧光信号标记特异性探针，一次性对患者痰液中的曲霉菌、新型隐球菌和耶氏肺孢子菌的核酸进行检测；同时采用内源性内标基因对样本的采集质量进行监控，保证样本质量，避免重复检查，亦可及时发现感染并鉴别病原体种类，为侵袭性肺真菌病的早期诊断和后续诊疗提供辅助诊断意见。
