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南通大学附属医院周国雄团队
2024年3月22日于
Phytomedicine（IF=6.7）
发表中药学研究论文
《Mechanism of Nicotiflorin in San-Ye-Qing rhizome for anti-inflammatory effect in ulcerative colitis》
三叶青根茎中Nicotiflorin对溃疡性结肠炎的抗炎作用机制
（原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0944711324002290）
点击阅读全文或在公众号内发送关键字“三叶青UC”即可获得文章PDF。
研究亮点与发现：
三叶青根茎提取物能够治疗溃疡性结肠炎；
关键成分：Nicotiflorin；
机制：Nicotiflorin通过抑制NF-κB通路和NLRP3炎症小体的激活而发挥有效的抗炎作用。
重点摘要
研究背景：
溃疡性结肠炎（UC）的发病率在全球呈上升趋势，开发针对 UC 的药物迫在眉睫。
寻找天然产物的作用靶点对于药物发现、阐明药物作用机制和疾病机理具有重要意义。
三叶青（SYQ）是一种古老的中药材，但其根茎粉末是否对 UC 具有药理作用及其作用机制尚不清楚。
目的：
评估三叶青根茎粉对治疗溃疡性结肠炎的疗效，并对粉末中的化学成分进行分离和表征。进一步筛选其中最有效的化合物，并确定其治疗 UC 的潜在机制。
方法：
在体内，通过小鼠的体重、DAI评分、结肠长度、组织MPO活性、血清炎症指标等评估SYQ根茎粉对UC的治疗效果。
此外，还采用高效液相色谱法分离和鉴定了SYQ根茎粉中的特定化学成分。
然后，利用网络药理学，结合 CCK-8 检测法、NO 释放检测法和分子对接检测法，并结合 CETSA、DARTS、SPR 和酶活性检测法，对 SYQ 根茎粉中最有效的化合物及其治疗靶点进行了分析和筛选。
最后，利用 Western blot 和 ELISA 验证了关键化合物对靶标的生物效应。
研究结果:
1、体内实验结果：
三叶青根部粉末有效恢复了小鼠体重，降低了DAI和病理评分，下调了炎症生物标志物的表达，并恢复了结肠长度以及结肠上皮和粘液屏障。
图 1.SYQ 对小鼠 UC 具有治疗作用 （1）。（A）小鼠UC模型构建及SYQ给药处理流程图。（B）小鼠相对体重的变化（第0天为100%）。（C）小鼠DAI评分的变化。（D） UC 模型构建和 SYQ 给药治疗结束时的小鼠结肠照片。（E） 小鼠结肠的长度。（F）小鼠结肠组织的MPO活性。（G）小鼠血清IL-1β浓度。（H）小鼠血清IL-6浓度。（I）小鼠血清TNF-α浓度（ns p ≥ 0.05，* p < 0.05，*** p < 0.001，**** p < 0.0001）。
图 2.SYQ 对小鼠 UC 具有治疗作用 （2）。（A） 小鼠 UC 模型构建和 SYQ 给药治疗结束时小鼠结肠组织的 H&E 染色照片。（B）小鼠结肠组织的组织病理学评分。（C）小鼠结肠组织AB-PAS染色的照片。（D）评估FITC-葡聚糖在小鼠结肠组织中的渗透性。（E）小鼠结肠组织E-钙粘蛋白IF的照片。（F） E-钙粘蛋白相对平均荧光强度（MFI）。（G） 小鼠结肠组织 Occludin IF.（H） 闭塞素相对MFI（ns p ≥ 0.05，* p < 0.05，**p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001）。
总之，我们的研究证明了SYQ在治疗小鼠UC方面的治疗潜力。
2、化学成分分析：
通过HPLC从SYQ根部粉末中分离并鉴定出9种化合物。
其中，Nicotiflorin是SYQ中含量最高且最有效的化合物。
图 3.SYQ根茎粉末成分的分离和鉴定流程图。
3、分子机制探索：
网络药理学预测、分子对接分析、CETSA、DARTS、SPR和酶活性测定表明，Nicotiflorin可能通过靶向p65并抑制NF-κB途径，从而抑制NLRP3炎症体的激活，最终抑制炎症。
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4、验证实验：
使用Western blot和ELISA实验验证了Nicotiflorin对关键靶标的生物学效应。
图 7.p65是烟苷的关键靶标。（A） CETSA测定的流程图。（B） CETSA测定样品的WB验证结果。烟苷处理的p65蛋白具有较好的热稳定性。（C） 分析CETSA测定样品WB验证结果的相对灰度值。（D）DARTS测定的流程图。（E） DARTS测定样品的WB验证结果。用烟苷处理的p65蛋白对旋前酶的耐受性更强。（F-G）烟苷和p65的Biacore分析结果。这些点代表不同浓度的烟苷。Nicotiflorin 与 p65 结合，KD 为 47.39 nM。（H） p65的酶活性。烟苷处理的蛋白中p65蛋白活性显著降低。
Nicotiflorin 通过抑制 NF-κB 通路和 NLRP3 炎症小体激活来抑制体外炎症。
我们提取小鼠BMDMs并构建炎症模型，以研究Nicotiflorin对NF-κB信号通路的影响及其对炎症反应的影响。与3种不同浓度的Nicotiflorin（25、50、100μM）共孵育，随后检测p65、p-p65、IκBα和p-IκBα的表达水平。
结果表明，Nicotiflorin对NF-κB p65和IκBα的表达水平没有显著影响，但显著降低了NF-κB p65和IκBα的磷酸化。因此，Nicotiflorin对细胞炎症的抑制作用可以通过抑制NF-κB信号通路的下游来实现（图8A）。
图 8.Nicotiflorin通过抑制NF-κB活化和NLRP3炎症小体活化来抑制体外炎症。（A） 向 BMDM 中加入烟柳林后细胞中 NF-κB 信号通路物种的 p-p65、p65、p-IκBα 和 IκBα 的表达。（B-D） 将烟氟林添加到 BMDM 后细胞上清液中 IL-1β、IL-6 和 IL-18 的浓度。（E） 将烟氟林添加到 BMDM 后细胞中 Caspase-1、IL-1β 和 NLRP3 的表达以及细胞上清液中 Caspase-1 p20、IL-1β p17 的表达（ns p ≥ 0.05， * p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001， **** p < 0.0001）。。
结论:
我们的研究结果表明，三叶青根茎提取物具有治疗溃疡性结肠炎的特性。活性成分Nicotiflorin通过抑制NF-κB通路和NLRP3炎症小体的激活而发挥有效的抗炎作用（图9）。
图 9.用SYQ根茎提取物处理UC的示意图。SYQ根茎提取物中最丰富的成分是烟苷，也是抗UC治疗最有效的成分。它抑制NF-κB和NLRP3炎症小体的激活，从而发挥有效的抗炎作用。
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