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上海交通大学医学院附属瑞金医院/上海市创伤骨科研究所江敏、徐醒、奚小冰团队
上海交通大学医学院附属瑞金医院张佳慧为第一作者
于2024年2月15日
在Phytother Res（IF=7.2）上
发表中药学研究论文
“Phillygenin prevents osteoclast differentiation and bone loss by targeting RhoA”
连翘脂素通过靶向 RhoA 防止破骨细胞分化和骨质流失
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/ptr.8074
研究亮点与发现：
研究揭示了连翘脂素（Phi）通过直接靶向RhoA蛋白发挥作用，这是控制成骨细胞分化和功能的关键分子。
通过动物模型和体外实验，研究证明了连翘脂素能有效预防和治疗骨质疏松，显著减少骨吸收，保护骨质。
研究不仅发现了连翘脂素的骨保护效果，还详细阐述了其通过RhoA/ROCK1/NFATc1信号通路抑制成骨细胞分化的作用机制，为未来的药物开发和骨疾病治疗提供了新的策略。
重点摘要
背景：
连翘（Forsythia suspensa）是中医临床常用的传统中药，因其解热和抗炎作用而在中医中用于治疗传染病，有清热、解毒、排脓、散肿等功效。
然而，它在骨代谢中的作用尚不清楚。最近的研究揭示了连翘叶中丰富的化合物连翘脂素（Phi）具有抗骨质疏松活性。
目的：
本研究旨在探讨连翘脂素对体内外骨代谢的影响及其作用机制。
研究方法：
使用脂多糖诱导的小鼠颅骨骨质疏松和去卵巢手术诱导的骨丢失动物模型来鉴定连翘脂素的骨保护效果。
应用微型计算机断层扫描（micro-CT）、外周定量计算机断层扫描（pQCT）和TRAP染色等技术。
在原代小鼠骨髓巨噬细胞（mBMMs）上评估连翘脂素对OCs增殖和形成的影响。
使用RNA测序、活性基础蛋白质分析、分子对接、G-LISA和蛋白质印迹法（WB）等技术来检查Phi在mBMMs中的靶点和作用机制。
研究结果:
1、体内骨保护效果：
研究发现，连翘脂素（Phi）在体内显著抑制了由脂多糖（LPS）诱导的小鼠颅骨骨质疏松和去卵巢（OVX）手术诱导的骨丢失。通过微型计算机断层扫描（micro-CT）、外周定量计算机断层扫描（pQCT）和TRAP染色等技术的应用，观察到Phi能显著改善骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）等骨质量参数。
图1 展示了Phi对LPS诱导的小鼠颅骨骨质疏松的治疗效果。
(a) 显示了Phi的化学结构。
(b) 通过micro-CT分析选择的兴趣区域（ROI），用橙色圆圈表示（半径：5毫米）。展示了每组的三维重建颅骨图像。
(c-f) 分别测量并计算了每个样本的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁间距（Tb.Sp）。
(g) 对小鼠颅骨切片进行了固定、脱钙、脱水和切片处理，然后应用了HE染色和TRAP染色以显示来自SHAM、LPS和LPS + Phi（30 mg/kg）组的OCs。红色染色区域被认为是TRAP阳性OCs。
(h) 分析了每组骨组织视野中的OCs数量。
图2 展示了Phi对雌激素缺乏性骨质疏松症的治疗效果。
(a) 展示了三组在4周内动态体重变化。
(b) 展示了每组的股骨三维重建图像。股骨来自SHAM、OVX和OVX + Phi（30 mg/kg）治疗的小鼠，在6周治疗后的重建图像。
(c-h) 分别测量并计算了每个样本的骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨表面积/组织体积（BS/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁间距（Tb.Sp）。
(i-j) 对股骨切片进行了固定、脱钙、脱水和切片处理。随后进行了TRAP染色和HE染色，以显示来自SHAM、OVX和OVX + Phi（30 mg/kg）组的OCs。红色区域被认为是TRAP阳性OCs。
(k) 分析了每组骨组织视野中的OCs数量。
(l) 分析了每组骨组织视野中的成骨细胞数量（OBs/BS）。
2、体外成骨细胞生成抑制：
在体外实验中，连翘脂素显示出对原代小鼠骨髓巨噬细胞（mBMMs）成骨细胞生成的抑制作用。通过TRAP染色和定量分析，Phi被证实能以剂量依赖性方式减少成熟成骨细胞的形成。
图3 展示了Phi抑制成骨细胞分化和骨吸收的效应，且没有细胞毒性。
(a) 通过CCK8实验检测了不同浓度的Phi（0, 1, 2.5, 5, 和 10 μM）或阿伦膦酸钠（Aln，100 μM）处理48小时后mBMMs的细胞活性。
(b) 通过TUNEL实验检测了Phi和Aln对mBMMs细胞凋亡的影响。TUNEL阳性细胞在荧光图像中显示为绿色。
(c) 通过BrdU实验评估了不同浓度的Phi处理后的mBMMs细胞增殖。
(d-f) 展示了Phi对mBMMs分化为OCs的影响，以及通过TRAP染色识别的TRAP阳性多核细胞的数量和面积的定量分析。
(g) 描述了实验的时间表，以确定Phi阻断成骨细胞生成的阶段。
(h) mBMMs在分化为OCs的过程中，有无Phi（10 μM）处理的TRAP阳性多核细胞的识别。
(i) 展示了不同处理组TRAP阳性多核细胞数量的定量分析。
3、直接靶点的发现：
通过化学蛋白质组学策略，Ras同源基因家族成员A（RhoA）被鉴定为Phi的直接靶点。连翘脂素与RhoA的结合通过分子对接和免疫沉淀实验得到证实。
图3: TG减少了APP/PS1小鼠大脑中的Aβ积累
A) 通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测量了APP/PS1小鼠大脑组织裂解物中的Aβ1–40和Aβ1–42水平。
B) 免疫组化（IHC）分析显示了TG显著减少了APP/PS1小鼠皮层中的Aβ斑块面积。
C) 使用荧光探针BC6染色海马和皮层的切片，可视化BC6染色的Aβ沉积（绿色）。比例尺=50 μm。与模型组相比，*p < 0.05，**p < 0.01表示统计学显著性差异。
4、作用机制：
连翘脂素通过靶向RhoA，抑制了Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶1（ROCK1）的活性，并调节了其下游的NF-κB/NFATc1/c-fos信号通路。这一机制对于成骨细胞的分化和功能至关重要。
连翘脂素靶向RhoA防止骨质流失
5、F-肌动蛋白环的影响：
连翘脂素还被发现能够通过cofilin和myosin1a抑制F-肌动蛋白环的解聚，这对于维持成骨细胞的形态和功能是必要的。
6、安全性和有效性：连翘脂素在30 mg/kg剂量下口服给药时显示出良好的耐受性和安全性，没有引起体重、肝肾功能指标的显著变化，也没有导致主要器官的病理变化。
7、潜在应用：研究结果表明连翘脂素是治疗骨丢失疾病的潜在选项，并强调了连翘作为一种预防骨疾病的天然方法的重要性。
结论:
连翘脂素（Phi）通过靶向RhoA蛋白，抑制RhoA/ROCK1/NFATc1信号通路，减少成骨细胞的分化和骨吸收，为治疗骨质疏松等骨丢失疾病提供了一种潜在的有效和安全的植物源性化合物。
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