脓毒症是一种危及生命的疾病，通常由病原体感染引发的免疫反应失调所导致，特别是革兰氏阴性细菌如大肠杆菌进入血液循环后，触发细胞因子风暴。脓毒症的致死性极高，目前临床上缺乏有效的治疗药物。
近年来，碳点作为一种新型的纳米材料，因其独特的结构和生物相容性受到了广泛关注。南开大学科研团队探索了一种创新治疗思路——利用对应致病病原体制备碳点，减轻其固有毒性的同时利用其与病原体部分相似的结构，竞争性抑制模式识别受体（PRRs）通路，缓解脓毒症进展。通过合成大肠杆菌细胞壁衍生碳点（E-CDs），研究发现其不仅能够降低炎症细胞因子的产生，保护器官功能，还能显著提高脓毒症小鼠的生存率。进一步的机制研究表明，E-CDs能够通过竞争性结合脂多糖结合蛋白（LBP），促进Toll样受体4（TLR4）通过溶酶体途径降解，从而抑制核因子kappa-B（NF-κB）的激活；此外，E-CDs具有类似还原性纳米酶的抗氧化特性，减少氧化应激损伤和线粒体DNA的释放，抑制STING通路的过度激活。总体而言，本研究证明了E-CDs能够通过协同沉默先天免疫通路抑制脓毒症中的细胞因子风暴，提示将病原体转化为碳点可能为类似脓毒症的感染性疾病治疗提供一种全新的策略。相关成果以“Suppression of Sepsis Cytokine Storm by Escherichia Coli Cell Wall-Derived Carbon Dots”为题发表在Advanced Materials 上。
1. 理化性质表征
基于之前的研究，本工作以纯化的大肠杆菌菌壁为前驱体，通过水热法制备了E-CDs并进行表征。TEM表明，E-CDs呈均匀的圆形，分散性良好。DLS分析显示其粒径为2.59±0.21 nm。X射线衍射（XRD）结果显示E-CDs为无定形碳。紫外-可见光吸收光谱在260 nm处有吸收峰，表明存在π–π*跃迁。荧光光谱显示其最大激发波长为496 nm，具有特征性的584 nm黄色发射。FT-IR和XPS分析进一步确认E-CDs表面富含–OH和–CHO基团，C、O、N的元素组成分别为66.59%、22.18%和11.23%。这些表征结果表明，E-CDs具有良好的物理化学特性，包括均匀的粒径分布、无定形碳结构和丰富的表面功能基团，为其潜在应用奠定了基础。
图1. (A)E-CDs的制备示意图。(B)E-CDs的透射电子显微镜(TEM)图像。(C)E-CDs的动态光散射(DLS)分析。(D)E-CDs的X射线衍射(XRD)图案。(E)E-CDs的紫外-可见光谱。(F)E-CDs的荧光激发(蓝色)和发射(红色)光谱。(G)E-CDs的傅里叶变换红外(FT-IR)光谱。(H-J)E-CDs的X射线光电子能谱(XPS)全扫描光谱(H)、高分辨率C1sXPS光谱(I)和O1sXPS光谱(J)。
2. E-CD 可减轻脓毒症小鼠的炎症反应
为了评估E-CDs对脓毒症的治疗效果，我们分别建立CLP与LPS诱导的脓毒症模型小鼠并进行给药后的生理病理观察。结果表明，E-CDs治疗有效缓解了小鼠的体温异常并提高生存率。进一步通过ELISA检测发现E-CDs治疗能够显著降低脓毒症模型鼠血清炎症因子的水平。此外，HE染色结果显示，E-CDs治疗组的模型鼠脏器损伤得到了显著改善。
3. E-CDs调节炎症环境中巨噬细胞的极化
巨噬细胞是脓毒症中的重要效应细胞。为了研究E-CDs对巨噬细胞的作用，我们首先评估了E-CDs的安全性及巨噬细胞对E-CDs的摄取情况。进一步的研究分析显示，E-CDs能够有效诱导巨噬细胞M2表型的增加，抑制M1型极化，并减轻炎症反应。
图3. (A)CCK8检测细胞活力。(B) RAW264.7细胞摄取E-CDs的荧光图像。(C)流式细胞术分析RAW264.7细胞对E-CDs的摄取。(D-E)流式细胞术分析LPS诱导并用E-CDs处理后M1和M2型巨噬细胞极化的比例。
4. E-CDs与LPS竞争性结合LBP蛋白，通过溶酶体途径促进TLR4降解
在脓毒症中，TLR4介导细菌识别及随后引发的炎症反应，其核心过程是TLR4识别细菌表面的LPS。LPS通过与LBP结合后经CD14传递至TLR4，从而触发炎症级联反应。进一步的机制研究发现，E-CDs与LPS均能结合LBP，且E-CDs能够显著破坏LPS与LBP的结合。TLR4信号通路的活化会触发MyD88和TRIF两大级联信号，其中TRIF途径依赖TLR4的内吞过程。研究发现，在LPS刺激下，细胞中TLR4表达显著增加，但E-CDs处理后其表达水平呈剂量依赖性降低。免疫荧光结果表明，E-CDs促进TLR4与溶酶体的共定位。在溶酶体抑制剂氯喹的作用下，TLR4表达水平不受E-CDs影响，这进一步支持了E-CDs通过溶酶体途径加速TLR4的降解。此外，E-CDs对TLR4下游信号的影响也得到了验证。综上，E-CDs通过抑制TLR4的信号传导并促进其通过溶酶体途径降解，有效缓解了LPS刺激下TLR4下游通路的激活，抑制了炎症信号的传递。
图4.(A)MST分析E-CDs对LPS与LBP相互作用的影响。(B)PLA检测LPS与LBP的相互作用。(C-D)流式细胞术分析RAW264.7细胞膜TLR4的表达水平。(E)共聚焦荧光成像和Pearson相关系数显示RAW264.7细胞中TLR4与溶酶体共定位。(F) Western blot分析氯喹对E-CDs诱导的TLR4溶酶体降解途径的抑制作用。(G) Western Blot显示E-CDs处理后RAW264.7 细胞中TLR4及其下游p-NF-κB、NF-κB、p-IRF3和IRF3的蛋白表达水平。
5. E-CDs减少线粒体DNA漏出并抑制STING通路过度激活
为了全面阐明E-CDs的作用机制，我们通过RNA-seq分析比较LPS刺激组和E-CDs处理组的差异。GO和KEGG富集分析结果进一步支持E-CDs对TLR4通路的调控作用。此外，E-CDs还影响了线粒体膜和线粒体呼吸、细胞质DNA感知通路。进一步分析发现，E-CDs通过发挥类似还原性纳米酶的作用，改善了脓毒症环境中的氧化应激损伤，从而实现对线粒体的保护，抑制线粒体DNA泄露对STING通路的过度激活。
图5. (A)GO富集分析。(B)GSEA分析结果。(C) Western blot分析E-CDs对cGAS、STING、TBK1和p-TBK1蛋白表达水平的影响。(D) RT-qPCR分析显示E-CDs对ISG相关基因表达的影响。(E)RT-qPCR分析显示E-CDs对Tomm20、Vdac1和Tfam mRNA水平的影响。(F)Western blot分析显示E-CDs对TOMM20、VDAC1和TFAM 蛋白水平的影响。(G)RT-qPCR分析细胞质中线粒体DNA的丰度水平。(H)荧光图像显示RAW264.7 细胞内dsDNA（绿色）和线粒体（红色）的定位。(I)使用Mitotracker Red和JC-1染色进行线粒体损伤分析。(J)E-CDs的DPPH清除活性和SOD活性测定。(K)ROS水平的荧光图像。
综上，本研究提出了一种新概念：通过碳化病原体自身开发具有潜在治疗作用的碳纳米材料。这一策略以大肠杆菌菌壁来源的碳点（E-CDs）为例，展示了其在脓毒症治疗中的显著优势。研究表明，E-CDs能够通过与脂多糖结合蛋白（LBP）竞争性结合，促进TLR4的溶酶体降解，抑制NF-κB信号通路的激活。同时，E-CDs具有卓越的抗氧化能力，可减轻氧化应激，减少线粒体DNA泄漏，从而抑制STING通路的过度激活。这些作用共同表明E-CDs在抑制细胞因子风暴、缓解炎症反应方面具有重要的治疗潜力，为脓毒症的干预提供了一种创新策略。未来，病原体衍生的纳米材料有望在炎症、感染和免疫失调等多种病理状态中发挥作用，并可进一步发展为靶向药物递送系统，为个性化治疗提供更多可能。
文献链接：
https://doi.org/10.1002/adma.202414237
*本文为课题组供稿。
投稿邮箱：
carbon-dots@foxmail.com
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