亚细胞器是活细胞的基本组成部分，进行着各种生化过程，是维持生命活动的基础。其中，线粒体是真核细胞中普遍存在的重要细胞器，是细胞内氧化磷酸化和ATP产生的主要场所。除了为细胞提供能量外，线粒体还参与调节细胞电解质平衡、细胞分化、信号传导和凋亡。溶酶体也是一种重要的亚细胞器，它含有许多水解酶，在许多生理过程中发挥重要作用，如细胞内运输，大分子循环，内吞作用和凋亡。研究表明，许多疾病与这些细胞器的损伤或功能障碍密切相关，包括阿尔茨海默病、帕金森病、癌症、神经退行性疾病、溶酶体贮积病、免疫系统疾病等。因此，这些亚细胞细胞器的精确成像对于理解相关的生理和病理行为具有重要意义。
迄今为止，各种荧光团，例如有机小分子、荧光蛋白、贵金属纳米团簇、半导体量子点、碳点（C-dots）等，已经被用于亚细胞器成像。在线粒体靶向方面，最常用的方法是静电吸附靶向。这是由于线粒体内膜中的电子传递链不断将质子从基质泵送到膜间隙，从而形成线粒体膜电位（MMP）。此外，具有内负外正电位状态的MMP会吸引带正电荷的基团。因此，阳离子和带正电荷的靶向基团，包括有机膦/硫盐、季铵盐、过渡金属络合物、胍等已经被修饰到各种荧光团上用于线粒体定位和成像。对于溶酶体靶，弱碱性亲脂基团，如吗啉和氨基，可用于通过静电和疏水相互作用的相应定位。
尽管静电吸附的线粒体靶向机制十分有效。但此机制无疑在定位过程会导致MMP的减少甚至消失。MMP不仅影响线粒体功能的完整性，而且对ATP合成、离子转运、细胞凋亡调节、抗氧化等具有深远影响。随着MMP的降低，细胞会对线粒体的变化进行一系列适应性反应，例如调整生产ATP相关蛋白质组的转录，减少ATP消耗等
为尝试解决该问题，安徽师范大学夏云生课题组发现并证明“极性”可以独立地作为细胞器水平标记的新型靶标，并成功应用于线粒体和溶酶体荧光成像。相关成果以“Polarity-Targeted Carbon Dots for Mitochondria and Lysosomes Imaging”为题，作为正封面文章发表在美国化学会的Analytical Chemistry杂志上，本文第一作者为安徽师范大学硕士研究生赵梦哲和林梦瑶，通讯作者为安徽师范大学夏云生教授。
基于课题组前期工作（J. Phys. Chem. Lett., 2024, 15, 6482−6488. Anal. Chem., 2023, 95, 2765-2773. Adv. Opt. Mater., 2022, 10, 2102827. Chem. Mater., 2020, 32, 8146–8157.），尤其是利用最近报道的聚酰胺色谱分离方法（Anal. Chem. 2024, 96, 13, 5095–5105），作者将以对氨基酚为前体合成的碳点进一步分离得到两种红色碳点，分别命名为C-dots-1和C-dots-2。两种碳点具有几乎相同的尺寸、组成和欧，仅仅是极性这一性质有所区别：C-dots-1和C-dots-2均为两亲性，log P值分别为1.54和0.95。与通常使用的阳离子细胞器探针不同，两种C-dots在生理条件下都具有弱负电荷表面（ξ-电位：-2.5至-7.5 mV）。有趣的是，无论在癌细胞还是正常细胞中，C-dots-1和C-dots-2对线粒体和溶酶体都具有高度选择性标记和成像能力。由于靶向过程不依赖于静电吸引效应，因此线粒体膜电位（MMP）在定位过程中基本保持不变。这有效避免了因MMP减少引起的细胞异常行为，如自噬现象。
图1. C-dots-1和C-dots-2的表征。（a、b、c）C-dots-1的TEM、HRTEM和AFM。（e、f、g）C-dots-2的TEM、HRTEM和AFM。（d）两个C-dots的HPLC色谱图。（h）Zeta电势图。（i）FTIR光谱图。（j）XPS光谱图。（k）C-dots-1和（l）C-dots-2的ESI-MS光谱（正离子模式）。
图2. （a-e）C-dots-1和（f-j）C-dots-2的极性。（a、f）在室温下加入正丁醇前后C-dots水溶液。在水-正丁醇混合前后（b）C-dots-1和（g）C-dots-2的吸收光谱。加入正丁醇前（c）C-dots-1和（h）C-dots-2水相的荧光光谱。加入正丁醇后（d）C-dots-1和（i）C-dots-2正丁醇相的荧光光谱。在加入正丁醇后，（e）C-dots-1和（j）C-dots-2水相的荧光光谱。
图3. C-dots-1的线粒体定位程度。C-dots-1与细胞器商业探针（线粒体蓝色探针（MLB）和溶酶体绿色探针（LTG））共孵育的4T1（a1-d1，f1-i1）、HeLa（a2-d2，f2-i2）和NIH-3T3（a3-d3，f3-i3）。共定位散点图（d1、i1、d2、i2、d3、i3）和相应合并照片（c1、h1、c2、h2、c3、h3），对黄线的荧光强度分析（e1、j1、e2、j2、e3、j3）。刻度：20 μm。
图4. C-dots-2的溶酶体定位程度。C-dots-2与细胞器商业探针（溶酶体绿色探针（LTG）和线粒体蓝色探针（MLB））共孵育的4T1（a1-d1，f1-i1）、HeLa（a2-d2，f2-i2）和NIH-3T3（a3-d3，f3-i3。共定位散点图（d1、i1、d2、i2、d3、i3）和相应合并照片（c1、h1、c2、h2、c3、h3），对黄线的荧光强度分析（e1、j1、e2、j2、e3、j3）。刻度：20 μm。
本工作进一步研究了C-dots-1的线粒体靶向机制。首先使用羰基氰化物间氯苯肼（CCCP）来处理细胞以降低或消除线粒体的MMP。处理后，分别用C-dots-1和Rhodamine 123（对MMP敏感的阳离子荧光探针）孵育细胞。对于C-dots-1孵育的细胞，在有和没有CCCP处理的情况下，荧光强度可以保持几乎相同（如图5 a-f）；而对于Rhodamine 123孵育的细胞，在CCCP处理后，荧光强度与对照相比表现出显著降低（g-i）。这些结果清楚地表明C-dots-1的线粒体定位不依赖于正负电荷吸引。
图5. C-dots-1不依赖于静电吸附的线粒体定位。在不同处理条件下与C-dots-1和MMP探针（Rhodamine 123）共培养的HeLa细胞的荧光图像。（a，b）未进行任何处理的对照组。（d，e）CCCP预处理的细胞。（g，h）孵育后固定的细胞。（c，f，i）对黄线的荧光强度分析。刻度：20 μm。
图6. C-dots-1定位对MMP的影响。在不同预处理条件下MMP探针（Rhodamine 123）孵育的HeLa细胞的荧光图像。（a）未进行任何处理的对照组。（b）CCCP预处理的细胞。（c）C-dots-1预处理的细胞。（d）线粒体阳离子探针MTR预处理的细胞。刻度：20 μm。
图7. MDC检测试剂盒用于研究细胞自噬行为。在不同预处理条件下MDC检测试剂盒检测的4T1细胞的荧光图像。（a）未进行任何处理的对照组。（b）HBSS预处理的细胞。（c）C-dots-1预处理的细胞。（d）MTR探针预处理的细胞。刻度：20 μm。
综上所述，本工作证明“极性”这一性质可以应用于线粒体和溶酶体的定位标记。与以前的静电依赖性机制相比，极性依赖靶向机制对细胞干扰较小。作者希望通过进一步研究，“极性”靶向策略可以开发为亚细胞器定位的通用的方法。
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