在非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗和管理中，精准的分子病理检测是关键。液体活检技术虽然前景广阔，但在检测基因融合等结构变异方面仍存在挑战。今年8月，北京医院发表于Cancer Medicine的一项研究：《Preservation of cfRNA in cytological supernatants for cfDNA & cfRNA double detection in non-small cell lung cancer patients》，创新性地保护cfRNA（cell-free RNA），并与cfDNA（cell-free DNA）联合检测，显著提高液体活检在NSCLC患者中驱动基因突变检测中的准确性，为NSCLC的精准检测和个性化治疗提供了新的视角。本文整理研究主要内容，以飨读者。
研究背景
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，NSCLC是其中的主要类型，当前临床指南如NCCN指南、CSCO指南等均推荐对晚期及转移性NSCLC患者进行全面的分子病理检测，检测内容主要包括11个驱动基因，EGFR、ALK、KRAS、ROS1、BRAF、NTRK1/2/3、METex14跳跃突变、RET和ERBB2（HER2）。
肿瘤组织学样本是临床适用最多的样本类型，也被认为是肿瘤分子检测的金标准，但是否有足够的组织学样本进行分子检测仍然是困扰肺癌分子病理检测广泛开展的重要因素。因此，除传统的肿瘤组织学样本外，研究还探索了使用各种细胞学上清液（cytological supernatant, CS）样本进行分子检测，如体腔积液、痰液、支气管肺泡灌洗液（BALF）和细针穿刺样本。
尽管液体活检技术在cfDNA检测领域展示出显著优势，包括非侵入性或最小侵入性、便于获取样本以及对单核苷酸变异（如点突变、缺失和插入）的高灵敏度识别，但在识别结构变异（如基因融合）方面，该技术仍存在一定的局限性。本研究提出了一种旨在保护各种细胞学上清液样本中cfRNA的新方法，通过同时提取cfDNA和cfRNA，并进行联合检测的策略，以提高NSCLC中基因突变检测的准确性。
研究方法
研究纳入2022年11月至2023年9月期间北京医院收集的111个细胞学上清液样本，包括26个体腔积液样本、16个痰液样本、60个BALF样本和9个细针穿刺样本。研究旨在确定细胞学上清液与cfRNA 保护溶液（protective solution, PS）混合的最佳比例，并通过RT-qPCR的循环阈值（cycle threshold, CT）值评估受保护cfRNA的质量。此外，研究还收集了84名NSCLC患者的恶性细胞学上清液样本及其匹配的肿瘤组织学样本，以及20个非癌症细胞学样本及其匹配样本（包括肺炎、慢性阻塞性肺病、支气管扩张、哮喘、间质性肺炎、肺脓肿、结节病、咯血和心力衰竭）进行基因分型。非癌症队列的纳入标准为在北京医院就诊的任何年龄≥18岁的个体。在注册前或注册时被诊断出任何类型恶性肿瘤的患者被排除在外。研究旨在验证受保护的cfRNA进行基因分型的可行性和准确性。对于cfRNA水平检测出基因融合的患者，临床随访直至疾病进展或2024年5月。
研究结果
1.评估cfRNA 保护溶液的保护效率
通过检测19个细胞学上清液样本中不同保护溶液与细胞学上清液比例（PS:CS）的RT-qPCR CT值评估cfRNA 保护溶液的保护效率。PS:CS比例为0:1、1:1、1:2和1:3的cfRNA 保护溶液中位CT值分别为24.18、21.68、22.87和23.14。1:1和1:2组的CT值显著优于0:1组（p<0.001；p=0.004），1:3和0:1组之间没有显著差异（p>0.05，图1）。此外，89.5%（17/19，1:1组）、73.7%（14/19，1:2组）和47.4%（9/19，1:3组）的样本CT值比未保护的细胞学上清液样本（0:1组）更优。68.4%（13/19，1:1组）、57.9%（11/19，1:2组）和31.6%（6/19，1:3组）的样本CT值＜23.0。不同CT值下，不同比例PS:CS中cfRNA保护比例（≤25.0、≤27.0和>27.0或无扩增曲线）见表1A。
图1 19个细胞学上清液样本中不同PS:CS比例的RT-qPCR CT值
表1 不同CT值下，不同比例PS:CS组中cfRNA保护比例
A：检测组（N=19）；B验证组（N=92）
基于以上结果，我们得出最佳的PS:CS比例为1:1。92个细胞学上清液样本被纳入验证组，对0:1组和1:1组成功保护数据进行比较。1:1组cfRNA的中位CT值为21.45，显著优于0:1组（25.08；p<0.001）（图2）。1:1组中91.3%（84/92）的cfRNA CT值优于0:1组，而在所有111个样本中为91.0%（101/111）。在验证组中，0:1组35.9%（33/92）和1:1组68.5%（63/92）的样本CT值达到或者低于23.0。不同CT值在验证组中的cfRNA保护比例见表1B，再次体现PS:CS比例为1:1时，保护效率最佳。
图2 92个验证组细胞学上清液样本0:1和1:1组的CT值
2.NSCLC组患者特征
表2总结了参与研究的84名NSCLC患者的临床病理特征。84名NSCLC患者中位年龄为70.5岁（39-92岁），大多数为男性（60.7%）。73名（86.9%）患者可获得完整的TNM分期信息，其中大多数人处于晚期（IIIB至IV期，91.8%）。58名（69.0%）患者治疗信息可知，其中42名（50.0%）为初治，16名（19.1%）为治疗后复发。20名非癌症患者的平均年龄为62.4岁（31-85岁），小于NSCLC患者（p=0.017）；60.0%非癌症患者为男性，与NSCLC患者无统计学差异（p=0.953）。
表2 参与研究的84名NSCLC患者的临床病理特征
3.细胞学上清液样本中驱动基因检测性能分析
对84个恶性细胞学上清液样本进行11个驱动基因突变检测，使用1:1的PS:CS保护cfRNA，用于后续基因分型。共有91.7%（77/84）的细胞学上清液样本成功完成检测，其中包括痰液和体腔积液100%（20/20；36/36）、BALF 85%（17/20）和细针穿刺悬浮液50%（4/8）；检测失败的样本（7/84）定义为CT值＞27或无扩增曲线。在20个非癌症样本中，无驱动基因检测呈阳性，证实了cfDNA和cfRNA检测100%的特异性。在77个成功完成检测的NSCLC 细胞学上清液样本中，总体灵敏度和特异性分别为93.8%（74/77）和100%（77/77）。在DNA水平上，肿瘤组织学样本的驱动基因阳性率为62.3%（48/77），细胞学上清液样本的单核苷酸变异/插入或缺失（SNV/InDels）检测为58.4%（45/77），总灵敏度为93.8%（45/48），特异性为100%（48/48）。
在77个 NSCLC 细胞学上清液样本中，cfDNA水平上检测到的最常见的突变类型是EGFR第19外显子缺失（20.8%，n=16），其次是EGFR第21外显子L858R突变（16.9%，n=13）。在cfRNA水平上，11个（14.3%）基因融合样本在匹配的肿瘤组织学样本中检测为阳性，细胞学上清液样本中基因融合检测结果相同，显示出100%的灵敏度和特异性，包括7个（9.1%）EML4-ALK融合，2个METex14跳跃突变，1个ROS1基因融合，以及1个RET基因融合。细胞学上清液样本的灵敏度分别为BALF 94.1%，体腔积液 97.2%，细针穿刺样本 100%，痰液 95.0%。对于不同疾病分期，I–IIIA期的灵敏度为100%，而IIIB–IV期为95.2%。在治疗史方面，初治的灵敏度为97.1%，治疗后复发为87.5%。
图3 细胞学上清液样本对比肿瘤组织学样本的热点突变检测谱
4.基因融合患者的随访
在11个cfRNA水平检测出的基因融合样本中，患者中位随访时间为8个月（4-14个月）。中位PFS为14个月（n=10）。在所有接受靶向治疗的10名患者中，ORR为60%，DCR为100%。
研究结论
本研究创新性地在细胞学上清液样本中保护cfRNA并结合cfDNA的联合检测策略，显著提高了NSCLC患者关键驱动基因突变检测的准确性。研究不仅确定了最佳的cfRNA PS:CS比例为1:1，确保了cfRNA的质量和可用性，而且在84个恶性细胞学上清液样本中实现了高达91.7%的检测成功率，其中总体灵敏度和特异性分别达到93.8%和100%。特别值得注意的是，在cfRNA水平上，11个基因融合样本在匹配的肿瘤组织学样本中检测为阳性，显示出100%的灵敏度和特异性，强调了cfRNA在识别基因融合等结构变异中的关键作用，细胞学上清液样本中基因融合检测结果相同，也为进一步扩大cfRNA检测的样本类别提供支撑。此外，对于检测出基因融合的患者，中位PFS为14个月，接受靶向治疗的患者ORR为60%，DCR为100%，表明该联合检测策略在指导临床治疗决策中具有潜在价值。
结语
北京医院此项研究通过创新性地保护cfRNA并结合cfDNA的联合检测策略，不仅拓宽了可检测的样本类型和基因突变类型（包括对靶向治疗至关重要的基因融合），也为指导NSCLC临床决策、制定个体化治疗方案提供了更精确的分子检测信息。未来，cfRNA和cfDNA的联合检测策略有望在NSCLC的早期诊断、预后评估以及新药开发中发挥关键作用，不断促进NSCLC的精准诊疗，并最终改善患者的生存率和生活质量，给肺癌治疗领域带来革命性的进展。
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