维多利亚大学Fraser Hof团队JACS：扩展磺化柱[6]芳烃——一种新的主体及其在直接口服抗凝剂结合中的应用

       磺化柱[6]芳烃（sP6）是一种超高亲和力的主客体体系，因其对生物相关分析物的高亲和力而在治疗应用中具有重大潜力。调整宿主支架的能力对于调控宿主的结合亲和力、选择性及药理学特性至关重要。但是，柱[6]芳烃的功能化方法非常有限。迄今为止，磺化-柱[6]芳烃的功能化一直未见报道。

       作者团队制备了具有延长输水表面的sP6衍生物，以适配直接口服抗凝剂（DOACs）的棒状结构。作者预测，通过扩展磺化柱[6]芳烃的疏水表面和腔体深度，将增强其结合强度，并通过调节主客体接触来实现客体的选择性的调整。此外，作者还针对单功能化和双功能化创造了在环状结构的一侧（A1sP6）或两侧（A1A2sP6）的带有延伸芳香侧链的新型衍生物，同时保持了12个负电荷的硫酸基团（图1b）。

图1：（a）pH为3.0时所选DOACs的化学结构及电荷状态。（b）Xue及其合作者先前报道的柱[6]MaxQ（sP6）的化学结构，以及本工作中功能化衍生物A1sP6和A1A2sP6的结构。

       功能化衍生物的关键起始材料是烷氧基保护的柱[6]环烷，最常见的是乙氧基柱[6]环烷。其功能化可通过两种主要的途径实现：脱保护和氧化。

       随后，作者为乙氧基柱[6]芳烃的A1和A1A2功能化开发了一条多步合成路径（图2）。通过在BBr₃存在下去除保护基团，实现了12个乙氧基中1个的单功能化，暴露出一个活性酚羟基。双功能化则是通过六个二乙氧基苯之一氧化为醌来实现。氧化后的醌可被还原为氢醌，从而提供两个活性醇基，此时，乙氧基柱[6]芳烃结构上可用单双反应位点进行更复杂的修饰，最终得到功能化的水溶性磺酸基柱[6]芳烃。

图2：sP6的A1和A1A2功能化路径的合成方案。

        在制备功能化衍生物后，作者首先考察了其对4’，6’-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）的结合亲和力，DAPI为一种棒状双阳离子客体。作者在柠檬酸盐缓冲液（CBS）和磷酸盐缓冲液（PBS）中分别研究DAPI和磺化柱[6]芳烃在pH为3.0和7.4下的结合行为。pH和缓冲液对宿主-染料复合物的荧光发射和激发影响甚微（图3a）。当与宿主结合时，DAPI在450 nm处（λ_ex=360 nm）的荧光发射有所增强，而宿主本身在这些波长下无荧光发射。通过将宿主直接滴到DAPI中，在两种pH下测定宿主-染料复合物的解离常数（K）（图3b）。三种宿主均表现出对DAPI的强亲和力，其中A1A2sP6表现出的亲和力最强，这体现了宿主功能化基团的扩展对客体亲和力的影响。

       通过DAPI的指示剂置换法，作者测定了DOACs的解离常数（表1和图3c-d）。其中，磺化柱[6]芳烃对达比加群、贝曲沙班和依度沙班表现出 微摩尔至纳摩尔级的亲和力，而对阿哌沙班未展示结合，利伐沙班与阿哌沙班结构类似，并且其不溶于实验条件，推测其并不是宿主的强亲和物。并且，增大的疏水区域也改变了三种宿主对DOACs的结合，其结合能力相对于母体，都表现出一定程度的提高。

图3：（a）DAPI（100 nM）,sP6-DAPI（1 μM；100 nM），A1sP6-DAPI（1 μM；100 nM）和A1A2sP6-DAPI（1 μM；100 nM）在pH为3.0（10 mM CBS）和pH为7.4（10 mM PBS）下的发射（λ_ex=360 nm，实线）和激发（λ_ex=450 nm，虚线）光谱。（b）DAPI（50 nM）在pH为3.0（10 mM CBS）下对A1A2sP6（1 μM-0.5 nM）的直接结合滴定数据。（c）在pH为3.0（10 mM CBS）（λ_ex=360 nm和λ_em=450 nm）时，将达比加群（10 μM-5 nM）加入到A1A2sP6-DAPI（62.5；50 nM）的指示剂置换滴定。（d）DOAC客体导致的宿主-DAPI复合物中DAPI的置换示意图，该过程会导致发射光减弱。

表1：基于荧光检测法测定的解离常数（K_d，nM）。

       扩展磺化柱[6]芳烃对直接口服抗凝剂（DOACs）的识别过程由焓驱动。作者通过等温量热滴定法测定了柱芳烃和DOAC结合的热力学参数。研究表明，磺化柱[6]芳烃及其类似物对测试的三种DOACs均表现出微摩尔至纳摩尔级的亲和力（表2，图4a-b）。与竞争性置换实验获得的解离常数相比，ITC实验中的值弱1-7倍，但是，宿主-直接口服抗凝剂（DOAC）偏好的总体趋势相同。总体而言，所有柱芳烃-DOAC复合物主要由焓驱动，熵的贡献较小。

        A1的扩展与母体sP6对达比加群具有相同的亲和力，但熵和焓的贡献不同。母体sP6具有不利的熵贡献，为2.2±0.2 kcal mol^-1；A1类似物将这种不利性降低至0.77±0.08 kcal mol^-1。增加疏水性表面积使熵有利的贡献增加了1.4 kcal mol^-1，同时等量地减少了焓的贡献。这可能是由于A1宿主的深度的增加阻碍了达比加群苯并咪唑部分与A1sP6上缘硫酸盐之间的阳离子-阴离子相互作用的最佳对齐（图4c）。A1A2的扩展对达比加群的结合力与母体sP6的焓损失为1.7 kcal mol^-1，熵增加1.2 kcal mol^-1，其焓损失可能是由于阳离子-阴离子相互作用的对齐不佳所致（图4c）。如在指示剂置换分析中所观察到的，依度沙班与贝曲沙班分别显示出与A1sP6和A1A2sP6的优先结合，并且均源于其相较于母体的焓变化。

表2：通过等温量热法测定的DOACs与磺化柱[6]芳烃识别的热力学参数。

图4：（a）在30℃下，CBS（10 mM，pH 3.0）中将A1sP6（250 μM）滴入达比加群（25 μM）的（DP）随时间变化的曲线图。（b）A1sP6与达比加群摩尔比与ΔH的关系曲线图。（c）展开的磺化柱[6]芳烃与达比加群相互作用示意图（负电荷表示磺酸基团）。

       磺化柱[6]芳烃与贝曲沙班的苯甲脒部分形成复合物，利用¹H NMR测定了贝曲沙班与扩展的磺化柱[6]芳烃的结合取向，将宿主滴定至贝曲沙班中，监测贝曲沙班的化学位移变化（图5）。2D核磁共振光谱（COSY）（图5a-b）显示，当加入0.5 eq（0.25 mM）的sP6时，苯甲酰胺甲基共振在3.32和3.10 ppm处的两个单峰汇聚并移至1.68 ppm的低场，表明胍基部分被包封入磺化柱[6]芳烃的疏水腔中（图5c），除甲基质子观察到的屏蔽效应外，芳香双峰（b）由7.70 ppm移至5.88 ppm的低场，进一步印证了sP6腔内的包封。然而，芳香双峰（c）仅向低场移动0.36 ppm，显示出相对较小的屏蔽效应。在加入等eq的sP6（0.5 mM）后，酰胺基甲基的共振峰进一步向低场移动了0.23 ppm。与此同时，相邻酰胺基的芳香质子（b）额外移动了0.30 ppm，而距离更远的芳香质子（c）仅向低场移动了0.06 ppm。这些结果都表明，sP6包封了利伐沙班的阳离子苯酰胺基部分，并形成了一个1：1复合物。

图5：（a）贝曲沙班的化学结构。（b）在含1%DMSO的20 nM CBS缓冲液（pD 3.0）中，1.0 mM sP6与0.5 mM贝曲沙班的COSY数据（红框内为贝曲沙班芳香质子b和c之间的相关性）。（c）在含1%DMSO的20 nM CBS缓冲液（pD 3.0）中，sP6（0-1.0 mM）加入到贝曲沙班（0.5 mM）中的滴定¹H NMR谱。

       增大芳香表面区域能增强主体与客体间的相互作用，在¹H NMR滴定过程中，A1sP6和A1A2sP6在复合后整体表现出更大的主体和客体信号展宽现象，这使得化学位移追踪变得更为模糊（图6a）。然而，从芳香质子（b）的低场偏移和胍盐（a）的级甲基基团可以看出，三种宿主的结合方式比较相似，作者基于NMR结果推测，贝曲沙班中的胍盐部分位于腔体内，并与宿主硫酸盐相互作用（图6b）。这将导致贝曲沙班的剩余芳香残基与宿主有更多的相互作用。初步的分子建模用于可视化磺化柱[6]芳烃与贝曲沙班的复合物，贝曲沙班根据相应的NMR滴定数据定位于宿主空腔内，并在Maestro13.8中使用OPLS-2005进行复合物的最小化（图6c）。最小化结构显示出A1sP6和A1A2sP6的悬挂臂与贝曲沙班之间的相互作用增加，与推测一致。

图6：功能化的类似物与贝曲沙班具有更多的相互作用。（a）贝曲沙班（0.5 mM），贝曲沙班（0.5 mM）和sP6（1 mM），贝曲沙班（0.5 mM）和A1sP6（1 mM）以及贝曲沙班（0.5 mM）和A1A2sP6（1 mM）在含有1%DMSO的20 nM氘代CBS缓冲液（pD 3.0）中的¹H NMR谱（由低到高）。（b）贝曲沙班与功能化的磺化-柱[6]芳烃的潜在增加的相互作用的透视图（负电荷表示磺酸基团）。（c）sP6-贝曲沙班，A1sP6-贝曲沙班和A1A2sP6-贝曲沙班（从左向右）的分子模型。

       由于A1A2sP6具有固体荧光特性，并对贝曲沙班结合呈现出剂量依赖性反应。嵌入的联苯基团使得其荧光强度相对sP6和A1的衍生物显著增加（图7a）.因此，作者探究了在复杂生物介质（如血浆）存在下，A1A2sP6与贝曲沙班结合的影响。将贝曲沙班逐滴加入到稀释的牛血浆中的A1A2sP6中，导致其荧光强度下降（图7b）。以330 nm处的发射强度绘制剂量反应曲线（图7c），据此估算出解离常数为7±2 μM，在缺乏A1A2sP6的对照逐滴实验中（图7d），未见显著响应。

图7：牛血浆中A1A2sP6对于贝曲沙班的剂量依赖的发射降低。（a）BioTek Cytation-5多模式读板仪采集的sP6，A1sP6和A1A2sP6的发射光谱（10 μM，在10 μM CBS，pH 3.0，λ_ex=270 nm）。（b）在稀释牛血浆（10%，蓝色线）中将贝曲沙班（180 μM，黑色线）直接滴定在A1A2sP6（90 μM，红色线）。保持A1A2sP6恒定，贝曲沙班浓度变化（180-0.7 μM，灰色线）。所有样品均含有1.8% DMSO辅助溶解，λ_ex=250 nm。（c）贝曲沙班在λ_em=330 nm对A1A2sP6发射（λ_ex=250 nm）的剂量依赖相应。数据拟合至1：1结合等温线以确定结合常数。（d）无A1A2sP6的对照滴定。

       总之，磺化柱[6]芳烃是一种超高亲和性，耐盐的超分子主体。通过开发A1和A1A2的合成路径，作者调整了主体空腔来影响客体的结合和选择性。A1sP6和A1A2sP6提供了更大的表面积，允许更多的形状和功能互补的客体的主-客体相互作用。A1A2的功能化显著提升了其对贝曲沙班的效力。作者证明，这些主体在生物学相关的盐介质和牛血浆中对未充分探索的药物类别——直接口服抗凝剂（DOACs）具有高亲和力。此外，通过合成功能化，A1A2sP6类似物对磺化柱[6]芳烃的荧光应用具有重要作用。

Title: Extended Sulfo-Pillar[6]arenes-a New Host Family and Its Application in the Binding of Direct Oral Anticoagulants

Authors: Chelsea R. Wilson, Austia O. Puckett, Isabella M. Murray, Allen G. Oliver, and Fraser Hof*

To be cited as: J. Am. Chem. Soc., 2024, Just Published.

DOI: 10.1021/jacs.4c03905