小分子半抗原抗体是首先被解析出高分辨结构的抗体，为针对维生素K衍生物的抗体NEW。在抗体NEW结构发表不久后，Segal等解析出抗体MCPC603的Fab片段与半抗原磷酰胆碱的结构（图1）。抗体-半抗原复合物结构的解析不仅揭示了抗体的结构组成，而且有助于理解抗体抗原相互作用，这些结构知识为之后的抗体工程技术提供了理论基础。如今，小分子半抗原抗体被广泛应用于分析检测。利用抗原抗体结合，半抗原抗体还可以作为化学合成物和细菌/真核表达系统中重组生物大分子的连接载体。其中，结合细胞表面抗原和半抗原的双特异性抗体（BsAb）衍生物，现已成为抗体工程领域的热点，可以应用于靶向或预靶向诊断和治疗，向特定组织或细胞递送有效载荷（如荧光分子、放射同位素、小分子药物、肽、蛋白、核酸和纳米颗粒等），在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。
图1. 与磷酰胆碱结合的抗体MC/PC603结构
1、小分子半抗原抗体和双特异性抗体衍生物
首先被设计改造成递送载体的抗体，包括地高辛（Dig）抗体和生物素（Bio）抗体，用于检测半抗原化核酸、肽或蛋白质。图2显示了抗Bio抗体与Bio衍生物（biocytinamide）的复合物结构，抗体识别结合经过修饰的生物素（维生素H）衍生物，但不结合未修饰（游离）的生物素。正因为如此，即使在含有内源性生物素的生物样品中，该抗体也可以捕获、递送或检测生物素化的有效载荷。通过X衍射对其可变区进行结构鉴定，生物素结合到抗体可变区CDR形成的结合口袋，生物素将它带负电的羧基朝口袋外侧。然而口袋外侧，抗体含有两个天冬氨酸残基（D31和D52），其侧链带负电荷。因此，当游离生物素要进入结合口袋时，生物素羧基和抗体天冬氨酸侧链之间的电荷排斥阻碍了它们的结合。而生物素衍生物（如与有效载荷偶联）中生物素羧基的电荷被“中和”，不会受到电荷排斥的影响，解释了抗体对生物素衍生物的高度特异性。
图2. 与生物素衍生物（biocytinamide）特异性结合但不与游离生物素结合的抗体结构（PDB 4S1D）
双特异性抗体的技术核心就是双抗技术平台，分子结构设计很关键。在最初开发多特异性抗体中面临的一个挑战是链相关问题，多特异性抗体不同的链必须以正确的方式组装才能有功能作用。图3为罗氏公司已应用于生产的双特异性抗体形式。Morrison利用灵活的连接肽段将具有不同结合特异性的scFv融合到lgG重链或轻链的C或N末端。然而，由于scFv本身不稳定，容易聚集，这种形式最初不适合大规模生产，因为scFv的聚集也使形成的抗体衍生物不稳定、容易聚集。随后在scFv的VH 44位和VL 100位（Kabat编号）之间形成链间二硫键，Morrison类与二硫键稳定的scFv结合产生的功能性双特异性抗体，具有低聚集倾向。第二种是2 + 1 IgG类bsAb，其H链的C末端分别融合VH和VL结构域，这种形式不需要Fv之间的连接肽接头，而是通过上述二硫键连接配对。这种形式在其H链中分别带有knobs or hole突变，由于“knob-knob”或“hole-hole”同二聚体在结构上是不相容的或不稳定的，迫使H链所需要的“knobs-into-hole”异二聚体的产生。单个Fv到IgG H链的双重连接，会影响某些抗原的结合。这种影响主要存在于大分子抗原上，由于小分子半抗原体积小，容易进出CH3结构域C末端与结合口袋形成的间隙，因此不容易受双重连接的影响。当较大抗原的结合受到影响时，可以蛋白酶水解其中一个连接。Fab类不含Fc的bsAb，含有二硫键稳定的Fv分别连接到CH1或CL的C末端，可以提供中等的药代动力学参数。将H链“knobs-into-hole”技术与Fab臂或VH-VL或CH1-CL交换方法相结合，产生“CrossMabs”形式bsAb，这种形式抗体在大小、形状和构造上几乎与普通IgG相同。
图3. 四种双特异性抗体形式。(A) 2+2 ‘Morrison-Type’ bsAbs: scFv通过链间二硫键（黄色）稳定；(B) 2+1 IgG类bsAbs: 含knob-into-hole的Fc区和二硫键稳定的VH和VL；(C) Fab类bsAb: 二硫键稳定的Fv分别连接到CH1或CL的C端；(D) CrossMabs: knob-into-hole突变产生H链异二聚体，Fab交换以保证轻链正确配对
2、工程化小分子半抗原抗体共价偶联有效载荷
抗体和有效载荷的连接可以分为非共价和共价。不对抗体进行修饰，这种连接通常是非共价的，抗体和半抗原化有效载荷之间连接的紧密程度取决于它们的结合和解离常数，但有时这种非共价连接可能引起有效载荷泄漏，造成“非特异”的全身反应。UlrichBrinkmann等以半抗原定向方式，通过自发的氧化还原反应形成二硫键，将半抗原化有效载荷与抗体共价偶联（图4）。通过小分子半抗原抗体结构分析，发现抗体与半抗原形成的结合口袋中，半抗原通常与CDR的N端和C端部分结合，而CDR的中间部分通常不参与半抗原的结合，因此适合进行突变改造。将小分子半抗原抗体上可用于工程化改造而不干扰半抗原结合的的残基定义为“rim区域”。通常不能给与较大的肽或蛋白质结合的抗体定义这样的区域，因为所有的CDR残基都可能参与与抗原的相互作用。最终在“rim区域”确定了一个保守的偶联位置，即VH 52+2（从Kabat编号52号位置往C端两个残基的位置）。进一步分析140个不同的抗体-半抗原复合物晶体结构，发现139个的VH 52+2位置位于“rim区域”，不与半抗原作用，提示该位置的普适性。
将VH 52+2位置突变成半胱氨酸（Cys），表面等离子共振结合动力学分析表明，Cys 52+2不改变半抗原（Dig、Biot和Fluo）与相应抗体的结合。将有效载荷通过二硫键定向共价连接到抗体上，需要在半抗原和有效载荷之间引入一个含有Cys的连接子。连接子的设计还需要满足以下原则：①连接位点不能影响半抗原与抗体相互作用，必须选择位于结合口袋外侧且不与抗体氨基酸残基相互作用的半抗原位点连接。在没有抗体-半抗原复合物晶体结构时，可以分析抗体对应免疫原的连接位点进行设计；②连接子需要有足够的长度和灵活性，以允许Cys定位形成二硫键。显然，Cys和有效载荷之间的长度也必须足够长，以保持有效载荷的功能特性，并避免有效载荷干扰二硫键的形成。应用该技术可以高产率地产生位点特异和结构明确稳定的抗体-有效载荷共价偶联物，反应简单、可调。
图4. 工程化小分子半抗原抗体通过半抗原介导的自发二硫键来共价偶联有效载荷。(A) 地高辛抗体（PDB 3RA7）Fab片段结构；(B) 工程半胱氨酸在抗体“rim区域”的位置，该位置非常接近多数小分子半抗原抗体的结合口袋，但不干扰抗体抗原结合；(C) 半抗原介导的自发二硫键形成将半抗原化有效载荷共价连接到抗体
3、小分子半抗原抗体调节小分子药代动力学特性
低分子量有效载荷肾脏清除快，药代动力学特性较差，在几分钟内就容易从血浆中清除，从而导致总体治疗效果较低。针对该问题，提出了许多半衰期延长策略：融合至白蛋白或Fc（与新生儿Fc受体（FcRn）结合，经历受体介导的循环）、附着到聚合物（如聚乙二醇化或羟乙基淀粉化）等。而半抗原介导的抗体-有效载荷复合物（非共价或通过二硫键共价）的出现为调节低分子量有效载荷的PK提供了新选择。Hoffmann等的研究表明，单独给药多肽PYY或Dig偶联的PYY衍生物，本身药物效力非常有限（消除快），但当它们与抗Dig抗体复合时，效力有所提高。用PYY-Dig-抗体复合物治疗的肥胖小鼠即使在48 h后也表现出食物摄入量减少，而单独给药多肽PYY仅在治疗后的1 h内显示出药物效应。
当有效载荷与抗体非共价连接时，可以实现缓释效果。非共价连接依赖于抗体-半抗原相互作用，off反应使有效载荷从抗体上释放。释放的低分子量有效载荷可以在组织中较自由移动，增加靶部位的载荷渗透。然而，由于抗体-半抗原作用的可逆、平衡特性，释放的有效载荷可以在循环中重新结合抗体（由on反应驱动）。因此，有效载荷可以在结合形式和游离形式之间转变，从而产生与常规持续释放不一样的“PK缓冲”作用。当通过半抗原介导的二硫键使有效载荷与抗体共价连接，可以进一步改善有效载荷的PK特性，在体内的血浆半衰期与IgG本身的半衰期相当（图5）。因此，可以选择不同的半抗原-抗体复合物来选择性调节半抗原化低分子量有效载荷的PK：使用非共价半抗原-抗体复合物，实现有效载荷的持续释放；使用共价半抗原-抗体结合物，实现体内的长时间IgG样稳定性；以及当半抗原-抗体复合物的靶点是胞内受体时，实现环境触发的有效载荷释放。
图5. 工程化小分子半抗原抗体调节小分子药代动力学特性。由于体积小，Bio-Cy5迅速从血浆中清除，(A) 与抗体形成非共价偶联物可显著延长其血浆半衰期；(B) 与抗体形成共价（二硫键）偶联物，可以进一步延长血浆半衰期
4、bsAbs靶向和预靶向递送有效载荷
结合小分子半抗原和细胞表面抗原的双特异性抗体可以作为递送载体，特异性地将（非共价或共价）有效载荷递送到靶细胞。非共价复合物经过抗体介导的内化过程，有效载荷在细胞内释放，从而促进有效载荷的摄取和提高载荷的活性效应。由二硫键共价的复合物在循环中更稳定，可以减少循环中有效载荷的提前释放，在细胞内通过二硫键的还原来释放有效载荷。图6显示了地高辛结合的bsAb复合物用于递送荧光分子Cy5和核酸有效载荷。靶向的细胞表面抗原可以是HER2、IGF1R、CD22或LeY等，通过bsAb和半抗原化有效载荷的简单混合形成复合物，将抗原特异性的有效载荷靶向递送到肿瘤细胞。
图6. bsAbs靶向递送有效载荷。(A) 地高辛-荧光团与bsAb复合物，靶向肿瘤相关细胞表面抗原（HER2），在肿瘤处积累有效载荷荧光团；(B) 半抗原-核酸与bsAbs连接，递送到靶细胞，有效载荷（红色）和bsAbs（绿色）在胞内囊泡隔室中分离
Schneider等通过地高辛结合bsAb将小干扰RNA（siRNA）定向递送到肿瘤细胞，但并没有实现靶基因沉默，研究发现是因为siRNA缺乏内体逃逸模块，不能释放到胞质中。之后通过将半抗原化siRNA包埋到支架复合物（如动态多聚偶联物DPC或脂质纳米颗粒LNPs）中，来增加内体逃逸模块。由于聚乙二醇（PEG）抗体的获得，以及PEG可以像半抗原一样连接到各种有效载荷（肽、蛋白质、脂质体和纳米颗粒）上，PEG结合的bsAb已经成功应用于PEG化有效载荷的靶向递送。除了靶向递送，有效载荷还可以通过bsAb实现预靶向递送。在预靶向中，bsAb和半抗原化有效载荷不会预先混合，而是在不含有效载荷下单独给药bsAb递送载体，使其分布结合到靶部位。随后给药半抗原化有效载荷，有效载荷迅速分布全身，被靶部位上的bsAb捕获，而没有被捕获的有效载荷被迅速清除，多数通过肾脏排泄。预靶向可以将有效载荷对非靶组织的非特异性效应和全身反应降至最低。
小分子半抗原抗体在免疫学，特别是在抗体领域发挥着重要作用。现在不仅仍然被广泛应用于分析检测，近几年也被工程化为有效载荷的递送载体，作为半抗原化有效载荷的非共价或共价连接模块，以向疾病组织或细胞靶向/预靶向递送有效载荷。
Dengl, S., Sustmann, C. andBrinkmann, U.(2016). Engineered hapten-binding antibody derivatives for modulation of pharmacokinetic properties of small molecules and targeted payload delivery. Immunol Rev, 270: 165-177.
原文链接：https://doi.org/10.1111/imr.12386
指导教师：王战辉
抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展，欢迎投稿！
长按下图识别图中二维码，轻松关注！
