【引语】
【成果简介】
作者选llama为实验动物进行免疫，利用常规VHH抗体制备流程进行基因扩增及建库。建库后设计三种文库淘选方案：（1）顺序梯度竞争：用100μg/L、20μg/L和1μg/L 的MC-LR分别进行第一、第二、第三次竞争洗脱。（2）同时竞争：用pH2.7甘氨酸洗脱，2M Tris中和后再用10fg/mL 的MC-LR孵育。（3）解离速率筛选：先用100μg/L 的MC-LR包被过夜，再用胰蛋白酶孵育洗脱。
利用顺序梯度竞争筛选方法将筛选到的抑制较好的阳性克隆进行测序。获得5株克隆，其CDR3区具有很高的相似性。利用间接竞争ELISA分析，发现这5株阳性克隆的IC50值均较相近，但遗憾的是均不符合检测要求。
淘选过程中的竞争洗脱(顺序梯度竞争)有利于筛选与分析物有交叉反应性的VHH抗体，但筛选出的VHH抗体不一定与分析物亲和力最好。这是因为竞争关系并不是同时发生的，首先，噬菌体与固相半抗原结合，洗涤后噬菌体需要先解离，才能够与溶液中的竞争分析物反应，这样不利于筛选解离慢的VHH抗体。为了避免这种情况的发生，即设计了第二种筛选方案。结果获得了与之前序列不同的3株阳性克隆。B2.2和C3.2克隆的IC50值与第一种筛选方法得到的克隆IC50值相近，但D9.2克隆IC50值为2.2 ± 0.06 μg/L，LOD为0.4 μg/L，虽然IC50提升了2倍，但LOD值不理想。
为了探索更多的筛选策略，作者设计了一种基于结合动力学的筛选方案，即解离速率筛选法。该方法有利于获得解离速率最慢的VHH抗体（对固相半抗原具有更高亲和力）。然而，并不能保证所得VHH抗体与分析物有很好的交叉反应性。利用该方法同样获得3株不同序列的阳性克隆，ELISA结果显示A2.3克隆的IC50为0.28 ± 0.021μg/L，LOD为0.4 μg/L；H11.3克隆的IC50为0.63 ± 0.064μg/L，LOD为0.08 μg/L。
由于微囊藻毒素类化合物结构相似，所以抗体通常表现出不同程度的交叉反应性。其中VHH H11.3对毒性较低的MC RR交叉反应性最好，而VHH A2.3对MC-LR最敏感。对水质样本进行添加回收实验，利用VHH A2.3抗体进行ELISA分析，结果显示回收率较好，表明该方法可直接用于微囊藻毒素的检测。
【图文导读】
图3 顺序梯度竞争法VHH抑制曲线
图4 同时竞争法VHH抑制曲线
图5 解离速率筛选法VHH抑制曲线
【小结】
作者探索了从同一文库中筛选抗半抗原纳米抗体的三种方法。三种不同形式的淘选策略获得性能不同的VHH抗体。其中第三种解离速率筛选法获得的VHH抗体灵敏度最好，其次是同时竞争法得到的VHH抗体；到目前为止，第二种和第三种淘选方法还未被应用到文库筛选中。虽然本文得到的结果可能是个例，对于其他化合物筛选结果有可能不同。但研究表明，除了标准的竞争筛选方法之外，探索不同的淘选策略来筛选针对小分子化合物的文库是极其重要的。与先前报道的抗微囊藻毒素类抗体相比，VHH A2.3抗体具有与之相似的灵敏度和交叉反应性并且可以直接用来分析未经处理的样品，其检测限远低于最严格的检测要求。
【原文出处】
指导老师：王战辉
抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展
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