【摘要】
本研究制备了具有快速可逆结合的未成熟抗体并对其结合动力学、稳定性和作为分析试剂的实用性进行了评估。以肌红蛋白为抗原并仅进行两次免疫，提高产生未成熟抗体的概率，这类抗体结合和解离过程中均能和靶标物快速反应，其速率常数分别高于1×106M-1s-1和1×10-3s-1，亲和力超过108M-1。当检测环境发生剧烈变化（如酸性pH）时，这些未成熟抗体的反应动力学转变为缓慢结合和解离，亲和力提升约10倍。检测环境转变前后的抗体结合性能发现均可在37℃下维持稳定超过1个月。作者认为这些快速可逆的未成熟抗体可视为向慢速结合抗体转变的中间态。将这种快速动力学抗体用作传统竞争免疫测定中时，因亲和力较低，导致灵敏度低于转变为慢速结合和解离后的抗体。本研究还进一步证明，将此类抗体与微流控无标记传感器相结合，可循环使用同一抗体而无需再生步骤，即可在血清中实现分析物的连续监测。
【引言】
多种天然生物学过程都会涉及快速可逆反应，例如细胞间相互作用、B 细胞受体介导的免疫监测、代谢物运输，以及病原体在感染过程中附着于宿主细胞的过程等。这类反应特性同样适用于体外环境下的抗原–抗体结合，特别是在免疫亲和色谱和对简单碳水化合物进行连续监测时。连续免疫传感检测作为一种新颖技术，为监测和识别疾病发生的早期预警信号提供了可能，如药代动力学研究中的临床观测、手术过程，以及败血性休克和急性心肌梗死（AMI） 等危及生命的情况。因此，连续免疫检测有望成为监测疾病早期信号的新方法。大多数免疫测定的原理是使用固定抗体捕获抗原，抗原-抗体复合物解离速度通常非常缓慢，限制了免疫吸附法的再生使用，这种方法一般都是一次性的，而不能重复使用。
为了在生理条件下重复使用抗体，需要抗体能够快速解离抗原，但这可能会降低抗体的结合力，比如低于 1×106 mol/L。但由于抗原–抗体反应是一个动态平衡过程，结合和解离的两个速率常数有可能同时增大。在体内免疫早期阶段（抗体未成熟阶段）可能会出现反应动力学较快的抗体，尤其在动物对同一抗原的免疫次数较少时（例如仅两次）。当动物长期重复接触抗原，通常会体细胞突变，产生高亲和力抗体。这种情况下，抗体可能具有慢反应速率，尤其是解离速率更慢，这就导致了相对于未成熟抗体来说更高的亲和力，例如亲和力可提升1000倍。在需要洗涤的常规免疫分析中，例如酶联免疫吸附分析(ELISAs)和蛋白质印迹分析中，可能优选此类慢动力学抗体。
本研究开发了一种具有快速反应动力学特性的肌红蛋白抗体，用于急性心肌梗死早期诊断。这些快速反应抗体来源于体内未成熟初级细胞（primary cells）的杂交瘤克隆。这些初级细胞是通过控制免疫次数获得的。随后通过化学处理调整亲和力，从而获得了反应较慢的抗体。
该研究首次探讨了抗体的体外成熟策略，为传统基因重组或噬菌体展示等传统技术提供了替代方案。作者比较了两种不同类型抗体在常规免疫测定中的热稳定性及分析性能（如灵敏度）。这种可逆抗体可以连续使用，用于连续分析。
【内容介绍】
1.从未成熟的免疫系统中产生抗体
本研究通过限制小鼠免疫次数至两次，每次间隔两周，筛选针对肌红蛋白具有快速反应动力学特性的单克隆抗体。相比常规四次免疫，这种方法可在分泌抗体的细胞高频突变之前进行杂交瘤融合，更有可能获得具有快速动力学特性的抗体。通过ELISA筛选出20个抗体克隆，并使用Octet Red无标记传感器系统测量其结合和解离速率常数，以评估其反应动力学。（图1，左）。
在筛选出的抗体中，大多数具有快速反应率，kon和koff值分别高于1×106M-1s-1和1×10-3s-1。而且，即使使用了较短的免疫周期，且结合和解离反应之间存在差异，大多数仍以亲和力常数(KA=kon/koff)在108和109M-1之间特异性地与肌红蛋白相互作用。例如Myo 3-4Bs和Myo 2-12H 两个抗体具有大致相同的亲和力，但其结合和解离速率常数相差10倍。表明具有快速动力学法的抗体可在不降低亲和力的前提下获得。（图1，右）。
具有不同动力学特性的抗体在不同的应用场景下都有其特定用途。慢动力学抗体适合传统免疫测定，这种情况下需要洗涤过量步骤；而快速动力学抗体适合于没有重生步骤的连续分析，如在线监测。该研究检测了获取的快速抗体的生化特性，这些特性有助于连续测量样品中分析物的浓度。
图1 使用短时间免疫提高抗体的动力学速率常数概况。大多数抗体在结合和解离方面都表现出快速的反应速率。两个速率常数(即亲和力)的比值在108和109M-1之间，在免疫测定的合适范围内。用于测定动力学常数的典型的结合和解离曲线见右图。图中所示的箭头表示克隆Myo 2-7Ds响应pH值突变的动力学转变。
2.抗体反应动力学的过渡 Transition of antibody reaction kinetics
基于快速动力学抗体的免疫分析中，抗体亲和力主要决定于分析物的浓度。对外周血中的肌红蛋白来说，其基础浓度男性为6-85 ng/ml，女性为4-60 ng/ml，患病时可增至基础水平的10倍。为了适应浓度范围，选用亲和力相对较低的抗体Myo 2-7Ds作为捕获抗体，这样可以避免样本被稀释。由于该抗体能迅速与抗原结合和解离，可在15分钟内实现浓度平衡，适合快速反应需求。
3.pH 效应
抗体从腹水中提取并经蛋白质G柱纯化。纯化后通过透析复溶至中性时，意外发现该抗体的结合和解离反应速率降低（变慢），这导致在预选确定的反应时间内，未达到反应平衡。作者推测这种动力学转变效应（kinetic transition effect）可能是由于使用酸性洗脱液(pH 2.5)收集结合在ProteinG表面的抗体所致。可以推断介质中剧烈的pH变化导致了抗体结构的构象变化（图2，Myo 2-7Ds）。为了验证其他抗体在亲和层析之后亲和力的变化，作者又用Myo 6-8D和Myo 2-11A经相同程序的纯化，发现了相同的动力学转变（图2，Myo 6-8D and Myo 2-11A）。作者得出结论，在动物未成熟免疫系统中，产生快速动力学抗体的超突变之前的细胞克隆来讲，发生动力学转变效应是普遍的。
酸性环境可能通过影响抗体互补决定区（CDR）的结构来改变抗体结合特性。常规抗体在经历超突变后，除非已经适应了酸性环境，通常需要经过复性才能恢复其结合特性（图3）。相比之下，未成熟抗体可能对外部刺激更为敏感。在酸性条件下，CDR区域可能发生质子化，这种变化可能通过氢键、离子相互作用或疏水作用影响其与结合受体的相互作用（图3），导致pH值恢复正常后，抗体结合位点转变为具有较慢反应动力学和较高亲和力的状态。此外，酸性条件也可以影响CDR以外的蛋白质结构，进而改变其结合动力学。尽管关于抗体动力学结合改变的机制非常重要，但是讨论其内在机制超出了本研究的范畴。
图2 蛋白G柱纯化后快速反应抗体的动力学活性转变。三种抗体- Myo 2-7Ds, Myo 6-8D和Myo 2-11A(见图1)-使用酸性洗脱缓冲液(pH 2.5)纯化。纯化后的反应速率，特别是解离的反应速率显著降低，因此亲和力增加了约10倍。
图3 缓慢或快速动力学抗体响应环境突变的结合动力学转变模型。慢速动力学抗体来源于动物的超突变后的免疫细胞克隆，而快速动力学抗体则来自仅免疫两次的动物的未成熟克隆。
4.动力学稳定性 Kinetic stability
本研究接着评估了抗体在动力学改变前后的热稳定性，检验其在物理应激下能否保持结合动力学特性。抗体在模拟体内环境的中性pH培养基中（37°C）储存30天，活性保持稳定，结合与解离反应速率仅变化15-25%。这表明无论是转变前的抗体还是转变后的抗体在中性环境下都能保持稳定，抗体的抗原结合位点对物理应激的抵抗力优于对化学条件（如酸性pH）的抵抗力。此外，即使在酸性洗脱液导致结构变化后，抗体仍能维持其结合特性，并在恢复到中性pH后保持其原始结合特性。
5.重复结合模式 Repetitive binding pattern
本研究进一步比较了抗体在使用固定在传感器表面的相同抗原的重复结合试验中的性能。单克隆抗体Myo 2-7Ds表现出快速动力学，在交替加入含或不含抗体的样品时，可以快速结合和解离抗原。抗体加入900 s后诱导了结合反应，抗体立即结合到包被抗原并快速达到平衡。结合复合物然后通过调整介质（例如casein-PBS）触发解离，恢复到抗体加入之前的状态。抗体-抗原的反应是如此之快，类似于信号开关。这种行为在8个重复周期内可高度重复（图4）。相反，转化后的抗体Myo 2-7Ds和4E2抗体在固定的反应周期内达不到平衡你，尤其是解离速率太慢导致结合复合物在逐渐积累。
图4 不同抗体(Myo 2-7Ds、转化抗体Myo 2-7Ds和4E2)与固定在无标记Octet Red传感器表面的肌红蛋白重复反应。Myo 2-7Ds与传感器完全结合并解离，以响应抗体的存在或不存在。相比之下，转化抗体Myo 2-7Ds和4E2表现出缓慢的结合动力学，免疫复合物逐渐积聚在表面。
6.具有不同动力学特性抗体在诊断领域的应用
两种具有截然不同动力学特性的Myo 2-7Ds抗体均可在不同的分析中用作捕获结合试剂。在传统免疫测定中，通常优先选择与抗原具有高亲和力的抗体，用于检测样品中存在的痕量分析物。由于传统免疫测定法通常在抗原与抗体的达到反应平衡状态下进行，因此反应动力学并不是重要考虑因素。即便对于基于非平衡状态的免疫测定方法，例如膜色谱法，抗原-抗体结合复合物也应在信号生成部位累积，此时具有缓慢解离速率的抗体更适合作为结合试剂。但是具有慢动力学的抗体若不采用严格的再生活化步骤，难以在连续测定中重复使用。具有快速反应速率的抗体无需严格的再生步骤即可重复使用，并可用于连续监测分析物浓度。
7.常规免疫测定法
为了比较不同动力学抗体的性能，本研究设计了一种竞争性传统免疫测定法。在微孔板中固定肌红蛋白作为包被原，并用HRP标记的二抗产生信号。使用三种不同反应动力学的抗体（Myo 2-7Ds、转变抗体Myo 2-7Ds和4E2）进行测试，并绘制标准样品中肌红蛋白的剂量反应曲线。抑制程度表示为存在分析物时的信号（B）与不存在分析物时的信号（B₀）的比值，并绘制成剂量-反应曲线，即样本中的肌红蛋白越多，B/B0值越小。结果显示，无论使用哪种抗体，抗体结合的信号均随着分析物浓度的增加而按比例下降。在固定分析物剂量下，抑制程度（分析灵敏度的度量）根据抗体亲和力的高低呈现出以下顺序：4E2>转变后的Myo2-7Ds>Myo2-7Ds。这表明抗体的亲和力是影响传统免疫测定法性能的更重要因素，超过了反应速率本身的影响，并且证明转变后的抗体也可用作传统免疫测定法的重要试剂。快速可逆抗体Myo 2-7Ds虽可用于传统免疫测定，但由于其亲和力相对较低，其性能不如其他抗体。
8.最少步骤免疫测定法 Minimum-step immunoassay
本研究尝试利用具有快速结合特性的Myo 2-7Ds抗体，开发一种需传感器和样本无需额外试剂，即可实现无人值守的急性心肌梗死监测的免疫传感器 。首先，作者采用了竞争性模式，使用固定化抗原的无标记传感器Octet Red；然而，两种抗原物质（应该是包被抗原和样本中的竞争抗原）之间对抗体的竞争结合并不容易发生。这主要是由于传感器的检测能力较低，导致需要更多的抗体，削弱了竞争强度。随后，作者采用了另一种无标记分析系统——表面等离子体共振（SPR）传感器系统（Biacore 2000），该系统配备了自动采样器和用于上样的微流控通道。抗体通过生物素-亲和素固定在传感器表面。通过微通道持续供应含肌红蛋白的样品，并可循环利用固定化抗体进行捕获。
实验中，逐步增加分析物的剂量（图5A），并通过重置条件后重复注入样品。将分析物样品通过通道注入传感器舱室持续300秒后，然后通过供应未含分析物的缓冲液进行1200秒诱导结合复合物解离。传感器信号与浓度在50至1000 ng/ml范围内呈正比，检测限低于50 ng/ml。这一分析性能足以检测临床浓度（例如，作为边界浓度的10^7 ng/ml），该浓度在AMI发作时可能有所变化。在血清中的实验也证实了抗体对肌红蛋白的高特异性，适合急性心肌梗死的早期监测（图5B）。
此外，作者发现肌红蛋白分子的正电荷与SPR传感器表面羧甲基葡聚糖层的负电荷之间存在离子相互作用，导致传感器响应的重复性较低。可以通过向介质中添加SDS可以抑制这一效应，并且在长时间检测样品流中分析物波动时，无论是通过每30分钟进行离散测量还是通过连续监测，这一问题都应能得到完全解决。通过比较SPR传感器的性能，尽管Octet Red传感器系统因其能够以低成本进行多次测定而在根据动力学特性筛选单克隆抗体方面相对有用，但该系统仍存在一些限制。传感器表面抗原-抗体复合物形成的光学检测灵敏度约比基于SPR的Biacore系统低10倍。
图5 采用固定化抗体Myo 2-7Ds的SPR免疫传感器对分析物浓度变化的剂量响应。该传感器的动态范围对肌红蛋白为50 ~ 1000 ng/ml，以酪蛋白- pbs为介质(A)，在发病的情况下，该动态范围足以测量临床浓度。剂量反应在人血清介质(B)中重现，表明Myo 2-7Ds的结合对分析物具有特异性。
【结论】
本研究通过限制免疫次数，从未成熟的免疫系统中制备了具有快速动力学特性的抗体，旨在开发能简化操作流程的新型诊断技术。研究发现具有快速动力学性质的抗体可通过介质pH的剧烈变化转变为具有慢速结合性能的抗体。这表明具有快速动力学性能的抗体类型可能是一种中间过渡形式，这种过渡型抗体通过体内高频突变途径再向高亲和力抗体进化。使用未成熟抗体作为无标记传感器的免疫测定中的结合试剂，该方法无需分离抗原-抗体复合物即可产生信号。这种方法实现了样品的连续分析，省去了再生步骤，减少了试剂和时间消耗，简化了系统配置。
【原文出处】
Kim DH, Seo SM, Paek SH, Lim GS, Paek SH. Premature antibodies with rapid reaction kinetics and their characterization for diagnostic applications. Anal Biochem. 2012 Jan 1;420(1):54-60. doi: 10.1016/j.ab.2011.09.006. Epub 2011 Sep 14. PMID: 21964440.
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.09.006
指导教师：王战辉
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