![]()
![]()
传统的杂交瘤技术以PEG作为融合剂，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合筛选杂交瘤，该方法融合效率低，只有小部分细胞（0.2-5%）表达抗原特异性抗体（图2），主要有以下几个原因。首先，小鼠的淋巴器官由多种类型的细胞组成，包括非B细胞系(40-60%)和表达IgM的所谓“幼稚”B细胞(40-60%)和其他淋巴细胞（<5%），任何一种细胞均可用于融合，但是只有表达IgG的B细胞（主要为生发中心B细胞）与骨髓瘤融合后才有可能形成分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。其次，有报道融合前对细胞进行分选的方法，但这些方法都涉及到直接对B细胞进行表面标记染色，然后利用物理压力分离细胞群体，对细胞存活率产生了负面影响。最后，电融合被报道比PEG介导的融合效率高得多，但在任何给定的时间可以使用的细胞数量都是有限的，必须设置多次电融合处理从免疫动物中获得的大量细胞。![]()
细胞分选分为正向分选和负向分选（图3）。本发明提供了通过负向分选富集表达IgG的B细胞来提高杂交瘤产生效率的方法。已知，抗原CD3/CD4/CD6/CD8/CD90/TCR表达于T细胞表面，抗原NK1.1/CD14/CD16表达于髓细胞表面，TER-119表达在红细胞上。因此，这些抗原可以用来去除IgM阳性细胞和非B细胞，从而分离IgM阴性的B细胞用于电融合和PEG介导的融合（图4）。电融合的最佳电压与细胞大小成反比，B细胞的平均直径为7µιη，而骨髓瘤的平均直径为12µιη。电融合之前可以利用CpG刺激IgM阴性的B细胞来增加其大小，从而优化电融合的效率。抗原特异性IgG杂交瘤的筛选，可以使用ELISA、流式细胞仪或成像来完成。该方法减少了无关杂交瘤克隆的培养和筛选，但抗原特异性阳性克隆的数量未减少。![]()
![]()
![]()
例1. CD43和IgM细胞的免疫耗尽
用抗小鼠IgM的磁珠去除IgM＋B细胞，用抗CD43磁珠去除非B细胞。CD43是一种表达于所有造血细胞的表面抗原，不存在于成熟的B细胞上。这两种融合前富集方法都导致细胞数量减少约2.5倍（图5），结果显示，在7.5×107的小鼠脾细胞中，约40-60% 为IgM＋B细胞，约40-60%为非B细胞。融合结果以含细胞克隆的孔数、含IgG产生的孔数和含有靶向特异性IgG的克隆的孔数来评定。图6显示，与未分选相比，与IgM耗尽的细胞进行电融合而获得的克隆大约减少了2倍，但含有产生IgG克隆的孔数以及含有靶特异性IgG产生克隆的孔数是相当的，而利用CD43抗体进行的融合前分选效果不理想。因此，可以通过融合前去除IgM＋细胞减少总克隆数来提高杂交瘤技术效率，而不减少分泌IgG的克隆和分泌靶向特异性IgG的克隆；而抗CD43磁珠不能用于融合前富集，需要一种替代方案来耗尽非B系细胞。![]()
例2. 小鼠脾细胞免疫去除法纯化和富集表达IgG的B细胞
联合抗小鼠IgM的抗体和小鼠Pan-B细胞分选试剂盒(Miltenyi)去除IgM＋细胞和非B细胞。该试剂盒包含多种针对细胞表面抗原的生物素化单抗，如CD4、CD90.2(表达在T细胞上)；CD11c、CD49b、Gr-1(表达在髓系细胞上)；以及Ter-119(表达在红细胞上)，然后用抗生物素的磁珠耗尽生物素抗体连接的细胞。结合两耗竭方法导致细胞数量减少约20倍（图7）。所有脾细胞，IgM—细胞，纯化的B细胞或IgM—B细胞分别进行电融合和PEG融合，每孔接种2xl04细胞和1.3xl05细胞。结果显示，与总脾细胞数量相比，其他三种耗竭策略获得的细胞克隆数分别减少3倍、20%和10倍（图8）。作者进行了8个独立的试验，获得了不同细胞群体中分泌抗原特异性IgG的杂交瘤克隆所占百分比信息（表2），由于技术原因，PEG的融合结果不一致。而电融合的总克隆孔数、产生IgG的克隆孔数和产生靶特异性IgG的克隆孔数比PEG的融合高约1.5~3倍（图10）。说明融合前B细胞富集更适用于电融合。![]()
![]()
表2 从不同细胞群体融合中获得的抗原特异性杂交瘤的百分比。(ND-未完成；*按产生抗原特异性IgG的克隆占活菌落总数的百分比计算)。
![]()
例3. 大鼠脾细胞中T细胞和表达IgM的B细胞的免疫耗尽
生物素化的抗大鼠IgM抗体和抗大鼠TCR抗体与大鼠脾细胞孵育，随后抗生物素的磁珠免疫耗尽生物素标记的细胞，结果表明T和IgM＋B细胞的联合耗尽导致脾脏细胞数量减少约9倍，与未分选的细胞相比，耗尽后克隆孔减少了大约10倍，但分泌抗原特异性IgG的克隆孔在克隆孔总数中的百分比增加了约5倍（图11）。![]()
例4. CpG刺激
联合免疫耗尽(非B细胞和IgM＋B细胞耗尽)进行融合前富集B细胞，分别用CpG或非CpG寡核苷酸刺激16h，流式细胞仪分析。通过前向散射(与细胞大小相关)测量，CPG刺激导致细胞增大(图12)，电融合结果表明增大B细胞可提高融合效率，且总克隆数、产生IgG的克隆数和产生抗原特异性IgG的克隆数增加了约2.5倍，但融合前的CpG刺激不会导致重复克隆频率的显著增加。（图13，表3）。![]()
表3 CpG刺激分离细胞提高电融合效率
![]()
例5. 微平行杂交瘤(MPH)的筛选
免疫耗尽的B细胞库(如100-300万个B细胞)可以排列成多孔(如2000×2000)阵列，每孔可容纳单个B细胞。还提供了1-300万个骨髓瘤细胞的单阵列，其中每孔能容纳~20微米直径的单个骨髓瘤细胞。将两阵列库的单孔对准，连接电极进行融合，融合细胞培养在阵列板中，用于随后的抗体检测和/或分离。这种“微平行”筛查方法可以将骨髓瘤和B细胞精确配对，通过减小电极间距(<100µm)而降低电压要求，从而提高了融合效率和杂交瘤回收率。而且，该方法可以对超低浓度的抗体进行分析，大大缩短了抗体生成和筛选时间。例6. 小鼠脾细胞RoboSep免疫去除法富集表达IgG的B细胞
通过MACS(Miltenyi)或全自动细胞分离系统(RoboSep; StemCell Technologies)富集表达IgG的B细胞。RoboSep的免疫耗竭，是将生物素标记的抗IgM抗体加入到针对表面标志物如CD4、CD8(表达在T细胞上)、CD11b、CD49b、Gr-1(表达在髓系细胞上)和Ter-119(表达在红细胞上)的生物素化单克隆抗体的混合物中。两种免疫耗竭方法导致细胞总数减少了大约66%，富集的B细胞进行电融合，总克隆孔数和分泌抗原特异性IgG的杂交瘤克隆数相同（图14）。![]()
例7. 从大鼠淋巴结中分离纯化表达IgG的细胞
使用RoboSep仪器通过免疫耗竭从大鼠脾脏或大鼠淋巴结分离的淋巴细胞富集表达IgG的B细胞。结果表明从淋巴结细胞耗尽中获得的细胞百分比与脾细胞相当，分泌特异性抗体的杂交瘤克隆数分别为39和6(图15)。
![]()
![]()
本专利公开了提高融合效率的方法，利用MACS系统，Pan-B细胞分选试剂盒或RoboSep全自动细胞分选系统免疫去除非B细胞和IgM＋B细胞从而富集表达IgG的B细胞；对比电融合和PEG融合表明，融合前富集更适用于电融合，且经CpG刺激增大B细胞大小也可提高电融合效率。这些方法大大减少了无效融合和筛选，但未减少特异性克隆，极大克服了现有技术中的不足。![]()
SEAGAL,JANE, BARLOW, EVE, H., HSIEH, CHUNG-MING, PAN, JEFFREY, Y., JENNINGS, SHAWN,M., LEDDY, MARY, R., THAKUR, ARCHANA, B.. METHODS FOR INCREASING THE EFFICIENCYOF HYBRIDOMA GENERATION[P]. WO2014093786,2014-06-19.
指导老师：王战辉
抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展
长按下图，轻松关注![]()
![]()
