本文来源于《中国科技信息》，2024,(11):29-31，如有侵权，请联系删除。
双特异性抗体（BsAb）能结合两个不同的抗原或抗原表位，可以实现多种功能。纳米抗体因分子量小、亲和力高、特异性强等优势备受关注。结合两者优势开发的基于纳米抗体的双特异性抗体药效好、稳定性和产量较高，可为抗体药物研发带来新动力。2022年9月26日，Ablynx开发的全球首款此类抗体Ozoralizumab（商品名Nanozora®）在日本获批上市。目前该领域的专利申请逐年增加，市场前景广阔。在此基础上，本文从专利角度进一步分析该类抗体的结构及功能，旨在为未来研发方向提供参考。
图1.Ozoralizumab 抗体结构
根据组成双特异性抗体的功能结构域类型，可将基于纳米抗体的双特异性抗体大致分为两大类：一种是抗原结合结构域由两个纳米抗体（VHH）组成，另一种是其抗原结合结构域由一个纳米抗体与一个包含重链可变区（VH）及轻链可变区（VL）的普通抗体组成。
1.两种纳米抗体作为抗原结合结构域所形成的双特异性抗体
1.1 两个VHH通过连接元件形成直链双特异性抗体
柔性肽是最常见的连接元件，通过调整柔性肽的氨基酸序列组成及长度可以优化抗体空间结构，实现多靶点特异性和亲和力。除此之外，连接元件还可以是E3连接酶、IgG Fc、NK活化结构域等，可以实现不同的功能。例如，WO2021214183A1使用E3连接酶为连接元件，确保分子可以被定制以降解特定的蛋白质靶标，进而对特定蛋白质的功能进行研究。此外，在上述直链双特异性抗体结构的基础上，基于对抗体活性的更高需求，可在其末端引入更多其他的功能活性元件。CN114621351A在双特异性抗体末端引入4-1BB共刺激因子，增强抗肿瘤效果。
1.2 与抗体CH1结构域连接的第一VHH结构域和与抗体轻链恒定结构域连接的第二VHH结构域经链间二硫键相连形成双特异性抗体复合体
CN117015374A中公开了这种类型的抗体：两种VHH分别与抗体CH1结构域或抗体轻链恒定结构域相连获得两条链，其中，在CH1结构域中包含F174C和 C233S取代，在轻链恒定结构域中包含S176C和C214S取代（根据Kabat编号），因而可实现两条链间二硫键的形成，制备出双特异性抗体复合体。考虑到抗体Fc段的功能，上述结构对改善双特异性抗体半衰期具备一定效果。
1.3 两个VHH分别与抗体恒定区Fc连接形成两条链，再经两条链上Fc的 knobs-into-holes（KIH）结构形成完整的双特异性抗体
此类结构比较有代表性的是CN114195900A所提及的双特异性抗体。具体可通过调整融合于Fc两端的VHH的数量，以达到不同的效果。可仅在Fc的一端连接一个VHH，也可以选择在Fc两端分别连接一个VHH 以提高靶点的结合效率。这类抗体在附加IgG Fc时通常都需要接头，以便灵活地同时结合不同的抗原，但是接头的柔性性质可能会使它们更易于蛋白水解，从而导致抗体稳定性差、不良的聚集性和增强的免疫原性。因此，在双特异性抗体制备过程中需要综合考虑上述因素并随时调整各元件组成以达到理想的药效。
2.纳米抗体与包含VH和VL的抗体作为抗原结合结构域所形成的双特异性抗体
此类双特异性抗体的抗原结合结构域为纳米抗体和包含VH 及 VL 的抗体，根据其结构的差异，又将细分为如下 5种结构：
2.1 VHH与scFv通过延长半衰期的抗体（HSA VHH）连接形成直链的双特异性抗体
此类双特异性抗体通过抗HSA抗体将VHH和scFv相连，实现延长双特异性抗体半衰期的效果，代表性抗体可参见WO2023088295A1所公开的相关内容。
2.2 三条肽链VHH-Fc、VH-Fc、VL，通过Fc之间的knobs-into-holes结构和 /或铰链区配对形成双特异性抗体复合体
此类属于较为常见的基于纳米抗体的双特异性抗体的结构类型，通过Fc-Fc界面可以用相互作用的氨基酸对（knobs-into-holes（KIH）残基、形成二硫键的半胱氨酸或具有相反静电荷的残基）来工程化，以便当它们共表达时，积极促进来自不同重链的异二聚体形成。具体实现异二聚体knobs-into-holes结构的突变组合有多种方式，但具体到纳米抗体与双链抗体形成双特异性抗体KIH 的结构，主要是通过静电转向效应或疏水相互作用效应实现，不同专利所采取的具体突变组合存在细微差异。选用不同的突变组合旨在改善同源二聚体形成导致的双特异性抗体产率低。WO2019122409A1公开了在CH2结构域中的N297位点进行N297A（根据EU编号）突变以减少或消除糖基化，在CH3结构域中进行 T366S/L368A/Y407V（根据EU编号）突变实现KIH结构以促进双特异性抗体中异二聚体形成。
2.3 纳米抗体分别连接在双链抗体的两条重链的C末端或N末端
CN116135884A公开了此类双特异性抗体，可根据实际应用需求、实施效果调整连接于重链的VHH的类型及数量。
2.4 纳米抗体插入双链抗体肘部区域
该结构于WO2019025391A1中公开，肘部区域具体指抗体重链和轻链中可变域和恒定域之间的连接点。此类抗体旨在提供更多样的双特异性抗体结构，在对抗体的稳定性、产量、亲和力等特性改进时可作为一种备选的抗体结构。
2.5 纳米抗体插入双链抗体重链的3A位点
WO2021218862A1公开了这样结构的抗体，纳米抗体插入双链抗体的CH3结构域中3A位点（根据EU编号，位置358至位置362的氨基酸），经修饰的免疫球蛋白十分稳定，并可稳定地以高水平进行表达。该结构的双特异性抗体主要致力于解决抗体生产过程中表达量及产品稳定性的问题。
结语
由于疾病的病因病机复杂，现有的靶向单一抗原的单克隆抗体在实际临床治疗中存在一定的局限和不足。而多特异性抗体可同时结合两个及两个以上靶标，能够同时发挥多种功能，以达到单克隆抗体联用所不能达到的效果。纳米抗体因其分子量小，在实际应用过程中具备易组装、低免疫原性、高稳定性等多方面优势，因此，基于纳米抗体的双特异性抗体在疾病治疗领域具有非常可观的应用前景。该类抗体的主要结构仍采取较为传统的双特异性抗体结构：通过连接肽将两种抗体（VHH和ScFv）相连或通过Fc的knobs-into-holes结构相连以解决抗体生产过程中的错配问题，少数发明专利公开了较为新颖的抗体结构。此外，靶点的亲和力也是双特异性抗体制备过程中还应考虑的一个重要因素。因而，设计合适的抗体结构以获得靶点特异性及亲和力均衡也是双特异性抗体研发过程的关键因素。本文通过对目前已进行专利保护的基于纳米抗体的双特异性抗体的结构进行梳理和总结，有助于创新主体初步了解该领域发展状况，并为今后的研发提供基础及创新思路。
原文出处
李梦华,孔维纳.专利角度分析基于纳米抗体的双特异性抗体的结构及功能[J].中国科技信息,2024,(11):29-31.
指导教师：王战辉
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