【摘要】
传统噬菌体展示方法扩增抗体基因、构建文库质粒时会损失文库多样性。本研究开发了一种可同时进行筛选和表达的方法，克隆纳米抗体文库并在培养基中自动表达，通过1-3轮稀释和筛选分离靶标特异性纳米抗体。最终，直接从免疫文库中分离出5个针对死亡域受体5（DR5）的纳米抗体和5个针对Pyrococcus furiosus （Pfu） DNA聚合酶的纳米抗体。值得注意的是，本方法无需专门的仪器即可进行纳米抗体筛选，在常规单克隆纳米抗体生产中具有广泛的适用性。
【引言】
纳米抗体与普通单克隆抗体不同，纳米抗体可以在大肠杆菌中高产量表达。将纳米抗体的N末端与分泌信号肽融合，可导致纳米抗体通过II型分泌系统或其他一些非特异性释放方式分泌到周质空间和细胞外环境中。此外，纳米抗体可以纳摩尔级别的亲和力特异性结合抗原。缺乏轻链使纳米抗体容易构建双特异性抗体，也易与E3泛素连接酶结合以特异性降解靶蛋白。由于这些特性，在热启动聚合酶链式反应（PCR）和嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法中也广泛使用纳米抗体。然而，纳米抗体的制备方法主要是噬菌体展示、细胞表面展示和核糖体展示。这些展示方法通常是劳动密集型的，且涉及单独的筛选和生产载体系统，特异性抗体的分离通常需要数月时间。此外，据报道，常用的噬菌体展示方法在扩增过程中会出现文库多样性损失的情况。因此，需要开发新的抗体发现方法来克服抗体库受限的问题。
本研究提出了一种快速、无偏差的方法来生成针对选定靶标的纳米抗体。针对死亡受体5（DR5）和Pyrococcus furiosus （Pfu） DNA聚合酶的两个免疫文库表达到培养基中。随着每个免疫文库转化的大肠杆菌的稀释和再生长，阳性纳米抗体克隆群每轮富集超过10倍，而文库多样性没有损失。然后直接从培养基中分离和纯化靶标特异性的单克隆纳米抗体。此外，这种筛选和表达纳米抗体的方法甚至不需要任何专门的仪器，提供了一种稳健、低成本、无偏差的方法来生成针对选定靶标的单克隆纳米抗体。
【内容简介】
1.纳米抗体在培养基中的分泌
本研究将pelB信号肽和来自商业天然文库（Qinhe Life Science Ltd.）的纳米抗体N端的His标签融合来构建表达载体（图1B）。正如预期，初步实验显示所有随机选择的5个纳米抗体均分泌到培养基中，并且在SDS-PAGE凝胶上呈现出清晰的条带（图1C），证明大肠杆菌分泌表达纳米抗体成功。这不仅便于以类似于杂交瘤技术的方式筛选单克隆纳米抗体，而且还能使用相同的表达载体和宿主细胞整合纳米抗体的筛选和纯化，这将大大减少时间成本。
图1 纳米抗体与传统抗体的差异 （A）常规抗体、VHH示意图；（B）构建和改造pET-22b载体；（C）分泌到大肠杆菌培养基中的各种纳米抗体的SDS-PAGE分析。
2.通过稀释和再生循环直接分离特定纳米抗体
单次免疫后，外周血中每106个B细胞约中含有101-4个分泌抗原特异性IgG的细胞。因此，直接利用有限稀释法来筛选特异性的单克隆纳米抗体通量过低。为了解决这个问题，本研究将B细胞分离，扩增其VHH基因片段连接到改造过的pET-22b载体上并转化到大肠杆菌中，这些细菌将使用96孔板进行培养并用IPTG诱导抗体分泌表达，每孔混合10n个克隆，这样，单个96孔板可以达到10n+2的筛选通量。诱导后的上清ELISA检测得到阳性孔。阳性孔经过稀释后再进行下一轮的诱导和检测，最后得到的细菌单克隆涂布到固体培养板上送测序，得到抗体的序列。
3.使用两个免疫文库评估方法的性能
首先用纯化的抗原蛋白DR5和Pfu DNA聚合酶对两只羊驼进行免疫。通过ELISA测定的IgG滴度证实了在免疫动物血清中产生了针对两种抗原蛋白的特异性骆驼抗体。用LeukoLOCK Total RNA分离试剂盒从淋巴细胞中提取总mRNA。PCR扩增两个免疫文库中的VHH基因片段，然后将其克隆到改进的pET-22b分泌载体中。对于Pfu DNA聚合酶纳米抗体，在用构建的纳米抗体编码载体转化大肠杆菌后，在96深孔板（A1板）的每个孔中接种约103个克隆，在2 mL TB培养基中进行第一轮筛选。A1板中的所有孔均用0.5 mM IPTG诱导12小时，然后离心收集上清液进行ELISA测定，以识别具有阳性克隆的孔。由于所有分泌的纳米抗体都在N端构建了His标签，因此将ELISA板与His二抗一起孵育，以检测特定结合的纳米抗体。筛选结果如图3A-3D所示。几个孔的OD450值大于1.0，表明这些孔中存在表达针对Pfu DNA聚合酶的特异性纳米抗体的大肠杆菌克隆。然后从阳性孔中取出104个克隆的分裂，稀释并均等分装到新的96深孔板（A2）中重新生长。由于将从阳性孔中取出的这104个克隆均匀分装到A2板中，每个孔将有100个克隆。某个阳性克隆出现在一个孔中的概率从1‰增加到1%（图 2）。经过2轮筛选，每孔克隆数为10个（图3C）。将阳性孔中的细胞用氨苄青霉素简单稀释并铺板到LB琼脂平板上，得到大肠杆菌的单细胞克隆。然后将单细胞克隆接种到另一块96深孔板（A3）中进行最后一轮筛选，得到特异性的单克隆纳米抗体（图2和3D）。最终分离鉴定出5个不同的纳米抗体（图3H）。对于DR5纳米抗体，相同方法，鉴定出5种不同的纳米抗体（图 3G）。经过Ni-NTA纯化后，纳米抗体的纯度>95%。这种针对特定目标的单克隆纳米抗体的集成筛选和纯化不需要将目的基因移植到新的表达载体中，从而简化了纳米抗体的发现。
图2 特异性纳米抗体的分离和表达方案
图3 Pfu DNA聚合酶和DR5纳米抗体的分离 纳米抗体培养基上清的ELISA结果。（A–C）ELISA检测1000（A）、100（B）、10（C）个不同纳米抗体表达克隆的上清对抗Pfu DNA聚合酶。*表示挑选用于下一轮筛选的阳性孔；（D和E）ELISA分别检测单个纳米抗体表达克隆的上清对抗Pfu DNA聚合酶（D）和DR5（E），⁑表示分离用于测序的单个克隆；（F）用转化了天然纳米抗体文库的大肠杆菌上清液以1:101、1:102、1:103和1:104的比例稀释不同DR5纳米抗体表达克隆的上清后ELISA监测数据；（G和H）系统发育树显示Pfu DNA聚合酶（H）或DR5（G）不同纳米抗体之间的遗传距离。
4.分离的纳米抗体对靶蛋白具有广泛的结合亲和力
等温滴定量热法（ITC）测定评估纳米抗体的结合亲和力。将DR5、Pfu DNA聚合酶及其相应的分离纳米抗体纯化，并在相同缓冲液20 mM HEPES、150 mM NaCl、pH 8.0中于4℃下透析过夜。结果显示，DR5纳米抗体与DR5的结合亲和力范围为18 mM-54 pM，Pfu纳米抗体与Pfu DNA聚合酶的结合亲和力范围为33 mM-35 pM（图4），证实本方法可以用于分离与靶蛋白具有广泛结合亲和力的纳米抗体。
图4 纳米抗体对其靶蛋白的结合亲和力 （A–D）DR5的两种纳米抗体（A和B）以及Pfu DNA聚合酶的两种纳米抗体（C和D）的ITC测量代表性结果。
5.纳米抗体与Pfu DNA聚合酶的结合表位
为了证明所制备纳米抗体的多样性，通过核磁共振（NMR）探测了不同纳米抗体在Pfu DNA聚合酶上的结合表位是否相互重叠，并在图5中进行了总结。根据相互竞争关系，图5B中绘制了所有5个Pfu纳米抗体结合位点的卡通示意图，各不重叠。
图5 Pfu DNA聚合酶纳米抗体的表征
【总结】
与广泛使用的筛选方法不同，本研究从理论和实践两个角度开发了一种纳米抗体的制备方法。采用一体化筛选和表达特定纳米抗体的方法省去了将纳米抗体亚克隆到表达载体的步骤。所需的直接工作包括cDNA生成（0.5天）、PCR（0.5天）、载体转化到大肠杆菌中（1天）、纳米抗体的筛选（4-5天）和纳米抗体的生产（2天）。整个工作可以在免疫反应产生后8-9天内完成，非常高效。本方法可以低成本地进行纳米抗体筛选，甚至不需要任何专门的仪器/设备。在无法使用读板仪的情况下，仍然可以通过肉眼识别阳性克隆。制备的靶向纳米抗体可直接用于大规模生产，大大简化了纳米抗体的制备过程。
原文出处：Tao Z, Zhao X, Wang H, et al. A method for rapid nanobody screening with no bias of the library diversity[J]. iscience, 2024, 27（2）: 108966.
指导教师：王战辉
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