摘要：本文介绍了一种针对黄曲霉毒素B1（AFB1）的单克隆抗体（Ab-4B5G6），该抗体具有高亲和力和特异性。作者利用Rosetta Antibody软件预测了抗AFB1抗体的三维结构模型，并使用Rosetta Ligand软件将AFB1与十个同源模型对接，产生了10000种结合模式。其中最佳得分模式预测了与重链上的四个位点（ALA33、ASN52、HIS95和TRP99）的强烈相互作用，这些相互作用仅涉及重链结构域。通过AF多聚体结合Rosetta Ligand获得的最佳得分模式与Rosetta抗体-配体计算模拟发现的Trp和His位点一致。通过突变实验证实了Trp在抗体中π相互作用，突变后的抗体（W99A）对AFB1及其类似物的结合亲和力降低了1000倍以上，表明Trp对CDR-H3区域稳定性的影响。此外，研究者还评估了两个糖酸衍生分子（AFB2-GA和AFG2-GA）的结合能力，这些分子因氢键结合力受损而显示出对Ab-4B5G6弱亲和力。作者成功分离出重链，其灵敏度和特异性与完整抗体一致。通过Rosetta Antibody建立了VH单域抗体的同源模型，对接分析揭示了相同的残基，包括Ala、His和Trp。与FV区域的潜在结合模式相比，VH模型的结果表明有七个模型涉及与Tyr32的疏水相互作用，Tyr是极性氨基酸，根据情况不同，它既有疏水性也有亲水性。本研究涵盖了Rosetta抗体-配体计算模拟的整个过程，强调了特定结构与在增强分子相互作用中的重要性。
【引语】
文章说明了一种新型单克隆抗体的研究，该抗体具有对黄曲霉素（Aflatoxins，AFTs）的高亲和力和特异性。文章指出了了解黄曲霉素与抗体相互作用的结构决定因素的重要性，这对于进行抗体设计的计算机模拟至关重要。研究人员之前已经通过DNA测序和全面的分子特征分析鉴定出了这种新型单克隆抗体Ab-4B5G6，它对包括AFB1在内的AFTs显示出不同程度的敏感性。文章提到了Rosetta软件在预测蛋白质结构和进行对接研究中的有效性，并介绍了使用Rosetta、AlphaFold-Multimer等方法进行同源建模和对接的技术突破。这些技术能够以原子级精度解释蛋白质和配体之间的相互作用，为抗体的额外生物学活性提供了洞见。在本研究中，研究人员利用Rosetta Antibody基于序列构建了针对AFB1抗体的3D结构，并使用Rosetta Ligand进行对接，以获得最佳的AFB1-抗体复合物模型。通过丙氨酸扫描发现的突变被引入以验证模型的预测能力，并计算了突变抗体与AFB1及其类似物之间的结合亲和力。同时还提到了使用AF多聚体进行抗体结构预测，并与Rosetta对接流程进行比较。最后，文章指出只有抗体重链中的残基参与了抗体-配体相互作用，并通过破坏二硫键和使用IAA阻断后，单域抗体VH显示出与AFB1及其类似物一档的敏感性。
【内容介绍】
通过分析（图1所示），确定了在重链互补决定区（CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3）中与黄曲霉毒素（Aflatoxins，简称AFTs）特异性结合的关键氨基酸残基。对CDR-H2、CDR-H3中的氨基酸残基进行丙氨酸扫描，计算序列突变引起的自由能变化（ΔG），以评估这些氨基酸残基在CDRs中的作用。
基于丙氨酸扫描的结果，选择特定的氨基酸残基（如99W）进行位点定向突变实验，以进一步研究其在抗体-配体相互作用中的功能。将完整的抗体序列进行密码子优化，以便于在哺乳动物细胞中表达，并使用既定的方法表达和纯化突变后的单克隆抗体。利用质谱方法验证突变单克隆抗体的存在，并分析其肽段。
评估表达的抗体（Ab-2N3A）对不同黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1）的亲和力。研究不同黄曲霉毒素和半抗原对对接模型的影响，通过同源建模将AFB1的类似物与之前描述的十个结构进行对接，分析总得分、界面得分和配体RMSD值。通过将AFB1与甘油酸反应生成AFB2-GA，来验证双键在2,3-二氢呋喃（2,3-DHF）中的位置对抗体-配体相互作用的影响。使用Pose View生成最佳模型的2D相互作用图，并通过比较不同模型的相互作用来验证模型的准确性。作者研究了VH在没有轻链的情况下对AFB1的亲和力，表明VH负责抗原结合的相互作用，在不牺牲灵敏度和特异性的情况下将小鼠抗体骆驼化提供了有价值的方法。
图1 Rosetta方案概述
通过预测抗AFB1抗体结构，计算评估AFB1最佳对接配合物。计算了10000种绑定模式与最佳绑定模式(红色显示)之间的RMSD。如图2所示，(A)抗AFB1抗体模型与AFB1对接后配体RMSD与界面delta评分的关系图。(B)总分与界面差值图。(C)配体RMSD与界面δ分数的关系图。按界面增量评分排名前10%的模型显示在这里。(D) 1000种结合模式通过配体RMSD聚类。图中显示了最大的三个簇，并根据配体RMSD绘制了最佳配体结合模式的界面delta评分。
图2 通过预测抗AFB1抗体结构计算评估AFB1的最佳对接复合物。
图3展示了ELISA实验的结果，比较了Ab-2N3A和Ab-4B5G6对AFB1的抑制情况。Ab-2N3A即使在最高浓度测试（100 ng/mL）时也没有抑制AFB1，而Ab-4B5G6对AFB1的半抑制浓度为0.1 ng/mL，表明Ab-2N3A的结合亲和力显著降低（>1000倍）。
图3 CDR-H2的丙氨酸扫描
图4展示了抗体（特别是重链）与黄曲霉毒素B1（AFB1）之间的相互作用。这些相互作用可能包括氢键、疏水作用以及其他非共价相互作用。图中突出了与AFB1结合的关键氨基酸残基，如Trp色氨酸）、His（组氨酸）、Ala（丙氨酸）和Asn（天冬酰胺）。这些残基位于抗体的重链上，并且与AFB1的亲和力和特异性密切相关。突变实验的结果表明，特别是W99A突变体（Trp99位点突变为丙氨酸）对AFB1及其类似物的结合亲和力的影响。这个突变可能导致了结合亲和力的显著降低，从而证实了Trp在CDR-H3区域稳定性中的作用。图中还展示了两个由甘油酸衍生的分子衍生物（AFB2-GA和AFG2-GA）与抗体Ab-4B5G6的结合情况。这些衍生物由于氢键结合受损，显示出对Ab-4B5G6的非常弱的结合亲和力。
图4 Ab-2N3A的CDR-H区的序列覆盖率
如图5，AFB 1和AFB 2-GA的取向明显不同（尽管抗体的姿态保持不变），表明这些类似物采用完全不同的构象。通过Protein−Ligand Interaction Profiler成功鉴定了最佳配体结合模式与AFB 2-GA之间的非共价相互作用。在位置95（His）和位置33（Ala）处存在配体和抗体之间的相同相互作用。因此，我们假设，由引入的乙醇基的存在引起的位置Trp99处的π堆积相互作用的阻碍是观察到的弱亲和力的主要原因。最后，各种AFT及其衍生结构的相对亲和力以IC50（ng/mL）表示。然后将这些值与Rosetta接口delta评分相关，如图5C所示。重要的是，Rosetta抗体配体对接能量与实验测定的结合亲和力具有统计学显著相关性，相关系数（r）为0.57。
图5 半抗原AFB1（A）和AFB2-GA（B）最佳对接姿势的磁共振侧视图
如图6A所示，SH封闭的重链和SH封闭的轻链的混合物（泳道编号1）在非还原SDS-PAGE条件下保持聚集在一起（由于链之间的相互作用）。此外，还可在约50和约25 kDa处观察到两条轻带。存在三个单独条带表明重链和轻链成功分离，以及它们之间的聚集状态。为了证实AFB 1结合亲和力仅存在于VH结构域中而不存在于VH + VL复合物中，采用蛋白G纯化柱从混合物中简单快速地纯化重链。结合抗体混合物并使用四次单独的1mL甘氨酸缓冲液洗涤（pH 1.7）从蛋白G柱洗脱四次。然后通过冻干浓缩洗脱级分，并使用非还原SDS-PAGE对样品进行鉴定（图6A）。对应于洗脱级别分1至4的蛋白质条带分别显示在泳道2、3、4和5中。在级数分1和2（泳道2和3）中，重链和轻链一起洗脱。然而，在级3（泳道4）中，仅获得重链（在两个先前洗脱步骤之后）。在第四次甘氨酸缓冲液洗脱期间没有进一步的蛋白质洗脱（泳道5）。然后通过ELISA分析从第三次洗脱获得的仅含有重链的蛋白质溶液（在与先前使用的相同条件下）。如图76B所示，结合敏感性被单个VH结构域保留，其对AFB 1、AFB 2、AFG 1、AFG 2和AFM 1的IC 50值分别为0.1、0.27、0.18、1.36和0.84 ng/ mL。总体而言，单个VH结构域的灵敏度和特异性均与完整抗体的灵敏度和特异性一致。这些观察结果表明，来自该鼠抗体的重链（仅含有VH结构域）完全保持其识别小配体的功能特性。
图6 (A)SH封闭重链和SH封闭轻链混合物（泳道1）和洗脱分级1至4（泳道2、3、4和5）的非还原SDS-PAGE结果。(B)该鼠抗体重链的灵敏度。
如图6B所示，结合敏感性被单个VH结构域保留，其对AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1的IC50值分别为0.1、0.27、0.18、1.36和0.84ng/mL。总体而言，单个VH结构域的灵敏度和特异性均与完整抗体的灵敏度和特异性一致。
【讨论】
本研究通过Rosetta抗体-配体计算模拟技术，成功鉴定并表征了一种对黄曲霉毒素具有高亲和力和特异性的新型单克隆抗体（Ab-4B5G6）。研究结果表明，该抗体对黄曲霉毒素B1（AFB1）及其类似物表现出不同程度的敏感性，为黄曲霉毒素的快速检测提供了潜在的生物识别元件。
首先，作者利用Rosetta软件平台进行抗体的同源建模和配体对接研究。通过对比10,000个对接模型，获得了最佳的AFB1-抗体复合物模型。这一过程不仅验证了Rosetta软件在预测蛋白质结构和进行对接研究方面的有效性，而且为后续的抗体设计和优化提供了重要的结构信息和参考数据。此外，通过丙氨酸扫描突变分析，进一步验证了模型的预测能力，并计算了突变抗体与AFB1及其类似物之间的结合亲和力。
值得注意的是，研究结果表明，只有抗体重链上的氨基酸残基参与了抗体-配体的相互作用。这一发现与以往的研究结果一致，即抗体的重链在决定抗体特异性和亲和力方面发挥着关键作用。为了进一步验证这一点，通过破坏二硫键并用IAA封闭后，制备了可变重（VH）单域抗体，并发现其对AFB1及其类似物的敏感性与原始抗体相当。这进一步证实了重链在抗体识别黄曲霉毒素中的重要性。
本研究的另一个重要发现是，通过AF multimer软件进行的抗体结构预测与Rosetta对接管线的结果具有一致性。这表明AF multimer软件可以作为Rosetta软件的一个有力补充，为抗体结构预测提供额外的参考。
尽管本研究取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。例如，目前的研究主要集中在抗体的结构和功能分析上，对于抗体的稳定性、生产成本以及在实际食品检测中的应用潜力等方面的研究还有待进一步深入。此外，对于抗体-配体相互作用的分子机制的理解仍然有限，需要更多的实验和计算研究来揭示。
总之，本研究通过计算模拟技术成功鉴定了一种新型单克隆抗体，并对其结构和功能进行了初步表征。这些结果为黄曲霉毒素的快速检测和食品安全控制提供了新的策略和工具。未来的研究将集中在优化抗体的性能，以及探索其在实际食品检测中的应用潜力。
【结论】
作者利用Rosetta软件平台，通过同源建模和对接技术，成功构建了针对黄曲霉毒素B1（AFB1）的单克隆抗体Ab-4B5G6的三维结构模型。通过Rosetta Ligand对接工具，研究者们对AFB1与抗体的结合位点进行了预测，并从中筛选出了最佳的AFB1-抗体复合物模型。通过丙氨酸扫描突变实验，研究者们发现Ab-2N3A抗体在第99位的丙氨酸突变导致其对AFB1的结合亲和力显著降低（超过1000倍），证实了该位点在抗体-抗原相互作用中的重要性。
研究还发现，除了第99位的色氨酸（W）参与π-堆叠作用外，AFB1与抗体的第33位丙氨酸（Ala）之间还存在氢键作用，这可能是影响抗体结合亲和力的第二个关键氨基酸。通过对AFB1衍生分子的合成和实验测试，作者进一步证实了双呋喃环15-16位的变化可能会影响与第33位丙氨酸（Ala）的氢键形成，从而在结合过程中发挥关键作用。研究还探讨了抗体Ab-2N3A的稳定性，发现多种参数和条件，如蛋白质结构、浓度、温度、界面和搅拌等，都会影响抗体的稳定性。
综上所述，这项研究通过计算模拟和实验验证相结合的方法，揭示了单克隆抗体与黄曲霉毒素B1相互作用的关键氨基酸残基，为抗体的设计和优化提供了重要的结构信息和理论依据
【原文出处】
Characterization of a Novel Monoclonal Antibody with High Affinity and Specificity against Aflatoxins: A Discovery from Rosetta Antibody-Ligand Computational Simulation. Changrui Xing, Guanglei Li, Xin Zheng, Peng Li, Jian Yuan, and Wenjing Yan. Journal of Chemical Information and Modeling 2024 64 (17), 6814-6826
DOI: 10.1021/acs.jcim.4c00736
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jcim.4c00736
指导老师：王战辉
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