【摘要】
当前半抗原设计仅考虑靶标结构特征，这可能是导致无法生成具有预期性能抗体的重要原因。为克服这一局限性，本课题组提出了一种新的策略，命名为抗体识别谱辅助半抗原设计（ARPHD）。该策略基于已报道的抗体、半抗原和靶标的结构信息及相互作用信息设计新半抗原。本研究中采用氟芬尼考（FF）和氟芬尼考胺（FFA）作为模型化合物，系统揭示了已报道抗体识别谱的作用机制辅助设计新型半抗原。研究证实，氟原子有助于FFA抗体的生成，而−COCHCl2片段则不利于诱导FF和FFA的广谱特异性抗体产生。基于ARPHD策略，本研究设计了四种不含−COCHCl2且含有氟原子的新半抗原。通过计算化学分析和动物免疫实验，成功诱导了可同时识别FF和FFA的抗体，且其IC50值分别为3.09和3.75 ng/mL。随后。对获得的抗体的分子机制进行解释，进一步验证了ARPHD的科学基础。最后，本研究建立了一种能够同时检测河水和动物源性食品中的FF和FFA的ic-ELISA，最低检测限为2.24 ~ 14.6 μg/kg。研究结果表明，ARPHD策略能够合理地指导半抗原设计，进而调控生成具有优良性能的抗体，且该策略理论上具有较好的通用性，可扩展到其他化合物的半抗原设计中。
【研究内容】
原理图ARPHD和评估的工作流程
1.抗体识别图谱辅助半抗原设计
目前，酰胺醇类化合物的半抗原设计策略直接基于靶标结构，没有利用抗原−抗体相互作用信息。对已报道的抗体识别谱进行深入研究，可为新型半抗原设计及预期抗体制备提供丰富的靶标表位信息。本研究提出了一种新型半抗原设计策略——抗体识别谱辅助半抗原设计（ARPHD），旨在合理设计半抗原以调节生成对FF和FFA具有均一亲和力的抗体（原理图）。首先，测定了本团队前期基于半抗原CAP-HS、TAP-HS和FF-HS制备的单抗2E10、16D4和4B3对FF及七种结构类似物的交叉反应性，结果表现出显著不同的识别谱。从分子结构上可总结出：远端的−NO2是CAP识别的一个重要特征；远端R1位点的−SO2CH3有助于抗体对TAP和FF的反应；R3位置的−COCHCl2和R2中的氟原子不足以使FFA被有效识别。随后对三种单抗与相应半抗原进行分子识别研究（图1C），抗体对接的结果表明，半抗原TAP-HS中的−C=O、−SO2CH3和−OH对FF和TAP的抗体识别至关重要。半抗原中的R2位置的氟原子和R3位置的−COCHCl2通过形成分子间相互作用调节了抗体对FF和FFA的识别。本研究也发现三种mAb的轻链几乎没有参与靶标的结合。
为了进一步验证抗体识别机制，对Fv 16D4和Fv 4B3的关键氨基酸进行了点突变。结果表明，由于mAb 16D4中的SER113和mAb 4B3中这两个氨基酸残基主要由半抗原中的−COCHCl2诱导并与其接触，因此TRP38对半抗原的识别至关重要，印证了半抗原结构中的−COCHCl2部分在诱导抗体性能中起着关键作用。此外，两个突变体抗体（scFv 16D4-SM（SER113ARG）和scFv 4B3-SM（TRP38VAL））的性能测定结果表明：SER113和TRP38在抗体识别中至关重要，而半抗原TAP-HS和FF-HS中的−COCHCl2部分调节了抗体识别谱。因此，为诱导具有均一亲和力的广谱特异性抗体的制备，半抗原中的−COCHCl2应予以去除，而R2位置的氟原子应保留。
图1单克隆抗体2E10、16D4和4B3的识别谱分析。（A）双霉素抑菌剂和主要代谢物的结构（B）交叉反应率测定结果（C）分子识别机制分析（D）单点突变前后的scFv16D4和scFv4B3测定结果
2.半抗原的设计、合成和完全抗原的制备
根据上述分析，定义了两个不含−COCHCl2但含有氟原子的半抗原片段，分别命名为Fragment 1和Fragment 2，连接位点A和B设置在相反方向（图2）。考虑到合成的可行性和刚性间隔臂的原则，设计了4种不同间隔臂类型和长度的新型半抗原用作免疫半抗原。此外，FFA作为异源包被半抗原（Hapten5），以提高免疫分析的灵敏度。
图2.两个片段和四个半抗原的化学结构（半抗原连接位点用红色标记）
首先使用计算化学对半抗原设计合理性进行评估（图3）。以FFA作为模板分子，通过分子叠合和原子电荷比较展示了这些半抗原的结构差异（图3A）。由于Hapten1中的苯环表现出明显的角度偏转，导致其与FFA的重叠相似度低于0.5；而受到O8、F11和N12基团轻微角度偏转的影响，Hapten2、Hapten3和Hapten4与FFA的重叠相似度均大于0.69（图3B）。Mulliken电荷分布同样表明Hapten1在电子性质方面的显著差异（图3C）。Hapten2、Hapten3和Hapten4的共同结构的分子表面静电分布基本与FF和FFA一致（图3D）。总之，与Hapten1相比，Hapten2、Hapten3和Hapten4在结构和电性上与FF和FFA表现出更高的相似性，而R1位置的−SO2CH3有助于保持与FFA的构象和电子相似性。
随后，采用化学合成法合成了上述四种半抗原，并通过质谱、核磁和紫外表征，证明所有半抗原和完全抗原合成成功。
图3半抗原的合理性评估。6种分子结构的（A）分子叠合结果，（B）构象相似性对比，(C) Mulliken电荷和（D）分子表面静电式分布
3.抗血清的鉴定和单克隆抗体的生产
经过细胞融合、筛选和四轮克隆后，最终获得了六个杂交瘤克隆。有趣的是，根据IC50值和交叉反应，这六种mAbs可分为三种类型（图4C）。其中，Hapten2生成的mAb 7E3对FFA的识别能力优于FF，其IC50值分别为3.46 ng/mL和10.63 ng/mL，归为I型。来源于Hapten2和Hapten4的mAbs（33B5、4F8和15C11）表现出较均一的IC50值，FF为4.30 - 22.35 ng/mL，FFA为11.14 - 30.91 ng/mL，归为II型。而来源于Hapten3的mAbs（3E4和4C8）仅特异性识别FF，归为III型。显然，对FF和FFA具有高亲和力的单抗倾向从hapten2和hapten4中获得，而hapten1和hapten3没有诱导本研究期望的单抗。
图4. 4种半抗原在第3次免疫后的免疫应答效果。(A)同源和异源ELISA的抗血清滴度。(B)各免疫血清在hapten 5-OVA下的抑制率。(C)基于IC50值的FF和FFA的单抗体类型。
之前所报道的含有−COCHCl2的FF半抗原未能产生同时识别FF和FFA并具有高且可比较亲和力的mAb。虽已有研究报道了三种多抗可同时识别FF和FFA并表现出较高的亲和力，这些抗体均以FFA作为半抗原。然而，由于抗体反应较弱，本研究未能成功制备小鼠mAbs，也未能重复pAb的制备。此外，来自免疫FFA的母鸡的IgY表现出对FFA的高特异性，但对FF的交叉反应率仅为1.56%。推测可能是兔子具有其独特的抗体进化机制和抗体结构能够产生更多样化的抗体。因此，发现具有更高FF和FFA亲和力的兔源单克隆抗体具有重要潜力。总之，研究结果表明，未修饰的FFA至少对于小鼠这一最常用的单抗制备动物来说，并不是生成FF和FFA抗体的理想半抗原。本研究通过开发ARPHD半抗原设计策略，成功制备了同时对FF和FFA具有可比较亲和力的小鼠mAb，并分析了其广谱特异性识别机制。
4. 对FF和FFA的单克隆抗体的广泛特异性机制分析。
在新半抗原设计中，用较小的氢键受体基团替代疏水性较高的-COCHCl₂可以诱导与FFA的氟原子相互作用的残基，从而进一步证明了通过ARPHD机制设计新半抗原以同时生成对FF和FFA的抗体的可行性。相比之下，代表III型识别特征的单抗4C8形成了深而收敛的结合口袋，这可能与半抗原Hapten3末端的苯环大基团有关。FF和FFA分子深嵌于大结合口袋中（见图5C）。然而，较小的FFA无法适配由Hapten3诱导的较大结合口袋，导致抗体与FFA之间的相互作用减少。4C8与FF和FFA的相互作用差异导致其亲和力相差超过40倍，抗体轻链中的配体结合残基差异尤其显著，基本决定了三种单抗对FF和FFA的独特识别特性。
图5. mAb7E3（A）、4F8（B）和4C8（C）的抗体识别机制分析
5.用于检测FF和FFA的icELISA检测的开发。
本研究选择了动物源性食品和河水样品进行分析，通过使用1%三氯醋酸对样品进行处理，建立了鱼类、鸡肉和猪肉样品的icELISA标准曲线，鱼、鸡肉、猪肉和河水样品在4倍、8倍、12倍和10倍PBS稀释后，基本消除基质效应。鱼、鸡肉、猪肉和河水样品中的FF/FFA的最低检测限分别为3.08/2.24、9.68/7.93、9.12/14.6和6.70/10.79 μg/kg，不同样品的回收率范围为67.5%-107%。此外，与HPLC-MS/MS结果之间的良好相关性表明，基于mAb 4F8的icELISA为同时检测真实样品中的FF和FFA残留物提供了良好的准确性。
【原文出处】
Peipei Li, Weilin Wu, Yuan Li, Zhihua Qin, Yingjie Zhang, Changfei Duan, Kai Wen, Xuezhi Yu, Jianzhong Shen, and Zhanhui Wang*. Analytical Chemistry.2024, 96, 50, 19869-19879.
https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c02962
指导老师：王战辉
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