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【摘要】

本文概述了抗独特型抗体（anti-idiotypes，Ab2）在竞争性、非竞争性及基于噬菌体免疫分析中的应用，包括检测模式及效果。无论是在竞争法中采用合适的Ab2替代半抗原衍生物，还是在非竞争法中采用针对一抗和半抗原复合物的抗伴型抗体，都能提高检测灵敏度，改善交叉率。Ab2的应用是未来体外诊断试剂盒开发的一个重要思路。此外，还对目前Ab2的开发方法进行了分析，较传统抗体开发技术，天然纳米抗体库可能是获取Ab2更为实用的一种方式。

【引言】

半抗原分子量小（一般<1 000 Da），缺少抗体结合的多个表位，因此半抗原的免疫检测存在固有的局限性，限制了半抗原免疫检测的分析模式。目前，半抗原的主流检测方法为竞争法，该方法需要将半抗原与载体蛋白相偶联再用于包被或标记，其中涉及复杂的化学偶联过程会导致批间变异难以控制，这也是导致半抗原免疫检测一致性差的主要因素。同时，有些半抗原缺少可用于化学偶联的官能团，必须改变原始半抗原的结构，引入合适的化学基团，但这种改变会影响半抗原的免疫反应性。此外，在毒素免疫检测试剂中需要用到具有毒性的偶联物或标准品，这会给用户、制造商和环境带来较大的安全风险。因此，用表位模拟试剂替代半抗原及其偶联物具有非常重要的意义与价值。

【抗独特型抗体的基本概念及其背景】

抗独特型抗体（Ab2）指针对第一抗体（Ab1）分子可变区的独特位产生的特异性抗体，独特位即免疫球蛋白高变区上的单个抗原表位。Ab2可以分为3种亚型：Ab2α、Ab2β和Ab2γ。其中，Ab2α识别抗体可变区的独特位，该独特位与互补位是相互分开的，因此Ab2α不会阻断抗原结合；Ab2β则结合互补位，直接阻断抗原的结合；Ab2γ的结合位置位于互补位或互补位附近，可能会因空间位阻干扰抗原结合（图1）。外位抗体和抗伴型抗体是另外2种类型的Ab2，外位抗体既可以结合抗原表位，也可以结合Ab1的独特位，而抗伴型抗体只结合半抗原和Ab1形成的复合物。

【抗独特型抗体的制备方法】

Ab2的制备主要方法有3类：①通过传统动物免疫的抗体开发技术，常用同种属免疫或异种属免疫2类免疫方式；②通过骆驼免疫抗体库或天然抗体库筛选纳米抗体；③通过合成抗体库筛选单链可变区片段。目前，关于制备Ab2所用的免疫原、免疫方法和其他关键试剂的文献报道较少，对于如何高效制备Ab2尚未形成相对一致的看法。

本团队在开发25-羟基维生素D、雌二醇和醛固酮非竞争法试剂的过程中，尝试用免疫小鼠方式制备针对半抗原和Ab1的抗伴型抗体。发现，如果Ab1是鼠源性抗体，将其与半抗原孵育后的免疫效果不佳，而采用非鼠源性抗体和半抗原共孵育才可以获得较好的免疫效果。采用弗氏佐剂乳化时，由于Ab1和半抗原形成的复合物可能在剧烈乳化条件下发生解离，因此在后续筛选中，针对Ab1和半抗原复合物新表位的抗伴型抗体阳性率极低。阳性率低的另一种原因可能是抗体结合抗原后引起的免疫复合物空间构象变化较小，且半抗原大部分包埋于抗体内部，难以形成新的有效抗原决定簇。此外，在筛选过程中，由于抗伴型抗体与Ab1以及半抗原组成的复合物相互之间接触表面积较大，难以实现对免疫复合物空间构象变化的精准识别，从而造成较高的非特异性干扰。

从天然库和合成多肽库中筛选Ab2的主要难点在于库容多样性不高，难以筛到高亲和力的克隆，且商业化的文库成本高。一般来说，需要用Ab1制备Ab2，但对于某些分子量很小的半抗原，难以制备半抗原偶联物用于免疫和筛选时，可以采用Ab2直接制备抗-抗独特型抗体，使其能识别原始的半抗原，以此制备的抗体与Ab1具有完全不同的结构特征。

【抗独特型抗体在免疫检测中的分析模式】

1.Ab2在竞争免疫检测中的分析模式

在竞争法中，半抗原主要用作标准品，也可用于制备包被抗原或者标记抗原偶联物。由于Ab2β模拟了半抗原并阻断了其与Ab1的结合，因此在竞争法检测中，可以用其替代包被抗原、竞争抗原或标准品，然而使用Ab2作为替代标准品对免疫检测方法分析性能的影响不一。

除用于半抗原的ELISA检测外，Ab2还广泛用于表面等离子共振、微阵列、电生物芯片以及在免疫层析中作为包被试剂或检测试剂。Tang等以Eu/Tb（Ⅲ）纳米球作为标记物，利用2种抗独特型纳米抗体开发了一种同时快速定量检测黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的时间分辨荧光免疫层析方法。该研究比较了2种不同的竞争检测模式，一种是将针对小分子的单抗包被硝酸纤维素膜，纳米抗体标记纳米球；另一种是将纳米抗体包被硝酸纤维素膜，小分子单抗标记纳米球（图2）。检测结果表明，后一种模式的灵敏度分别高了18.3倍和20.3倍。

2.Ab2在非竞争免疫检测中的分析模式

与采用同一Ab1的竞争法相比，加入Ab2是否有助于检测性能的提升取决于免疫检测方法学的设计和Ab2自身的性质。在非竞争免疫检测模式中，通过不同抗体的双重识别可以提高检测的灵敏度和特异性。在同时应用Ab2α和Ab2β的检测模式中，当半抗原结合到Ab1上后，Ab2α可以与Ab1的可变区结合。当Ab2β与Ab1结合时，由于空间位阻阻断了Ab2α的结合，通过检测Ab2α可以反映半抗原的浓度水平（图3）。

目前，采用抗独特型抗体进行小分子免疫检测的商业化产品很少，其中比较成功的是英国Selective Antibodies公司基于选择性抗体系统开发的免疫层析检测，该系统采用了2株抗体和1种阻断剂，其中1株抗体是针对半抗原的抗体Ab1，另一株抗体是针对Ab1的Ab2，阻断剂是1种半抗原-蛋白偶联物。在半抗原与Ab1结合后，Ab2仍可以结合Ab1，而未结合半抗原的Ab1被阻断剂结合后，由于空间位阻使Ab2无法结合。在免疫层析检测中，包被Ab1的纳米金与样本中的半抗原结合后，剩余的Ab1位点与阻断剂结合，半抗原的纳米金移动到固定有Ab2的检测线时，被Ab2捕获并显色，而结合阻断剂的纳米金则不会被Ab2捕获，因此样本中半抗原越多，显色越强（图4）。

除同时采用Ab2α和Ab2β的非竞争检测模式以外，也可以只采用1株抗伴型抗体与半抗原特异性单抗实现非竞争法检测。Omi等利用自主多样化库系统制备了针对雌二醇和25-羟基维生素D 2种半抗原-抗体免疫复合物的抗伴型单抗，并基于此建立了2种半抗原的全自动化学发光酶免疫检测方法，其中25-羟基维生素D的检出限可达2.1 ng·mL^-1，对1，25-二羟基维生素D3等类似物的交叉显著降低，且该方法与参考方法具有非常高的相关性。类似地，本团队也已经开发了针对25-羟基维生素D、醛固酮和雌二醇3种小分子半抗原的非竞争法试剂，并已经获批国内注册证，其分析性能相对于用同一株Ab1开发的竞争法，灵敏度、特异性和抗干扰能力均有显著提升（表1）。本团队对此类抗体的结合位点进行研究时发现，抗伴型抗体只识别Ab1可变区和半抗原结合后形成复合物的新表位，并不识别半抗原和Ab1本身，具体如图5所示。

3.基于噬菌体的Ab2免疫检测分析模式

基于噬菌体颗粒的Ab2免疫检测方法主要包括以下3种：①噬菌体展示ELISA；②噬菌体展示免疫PCR；③噬菌体展示免疫环介导等温扩增。这3种检测方法均采用噬菌体颗粒与半抗原竞争结合包被Ab1的模式。Lei等将构建了噬菌体展示免疫环介导等温扩增方法，采用了1种金属离子指示剂羟基萘酚蓝，当样本中含有黄曲霉毒素时，溶液颜色为蓝紫色，当样本中不含黄曲霉毒素时，溶液变为天蓝色（图6）。这种方法检测花生中黄曲霉毒素B1的检出限为1.6 µg·kg^-1，灵敏度不及该课题组建立的免疫层析法。分析可能的原因是毒素提取液中含有大量甲醇，为了消除溶剂和基质效应的影响，扩增前将样本进行了较大比例的稀释（16倍），因此降低了检测灵敏度。

【展望】

建立安全、特异、灵敏、快速的半抗原检测方法是目前众多检测领域的迫切需求。Ab2作为一种半抗原的替代，在竞争法中可以替代半抗原-载体蛋白偶联物作为竞争抗原，避免了毒性半抗原的使用，改善了交叉反应率。在非竞争法中，可以与Ab1联合使用，实现比竞争法更高的灵敏度和特异性。Ab1和抗伴型抗体相结合的非竞争检测模式可能代表了半抗原免疫检测未来的发展方向。Ab2是针对Ab1产生的，不同的Ab2对检测的性能有不同的影响，但要实现对半抗原的灵敏特异性检测，Ab1的性能也是一个重要的前提条件。尽管目前的初步研究已经证明，Ab2在半抗原免疫检测中对性能改善有较大的帮助，但Ab2的制备依然存在一定的难度，其筛选方法也难以标准化。在Ab2的制备方面，与动物免疫相比，免疫抗体库、天然抗体库和合成抗体库为筛选不同性质的Ab2提供了更多的可能性。在不改变Ab1的前提下，通过搭配使用不同的Ab2来提升检测特异性可能是未来的一个重要研究方向。

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