猪瘟病毒(CSFV)是一种具有囊膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科瘟病毒属。E2蛋白是CSFV的主要免疫原性蛋白及保护性抗原，在其N端由A、B、C和D四个抗原结构域组成，这些结构域包含一些构象表位和线性表位，它们对诱导中和抗体的产生起着关键作用。对比E2蛋白的不同表位表明：位于828-842氨基酸之间的CTAVSPTTLRTEVVK，是单克隆抗体WH303的识别区域，在不同的CSFV中高度保守，但在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和边界病毒(BDV)中差异很大。
单克隆抗体（MAbs）对大多数菌株的高抗原性可变病原体具有中和作用，具备发展成为被动免疫疗法或疫苗试剂的潜力。此外，mAb在研究感染源的结构、功能特性及相关致病机制等方面也发挥着重要作用。然而，通过杂交瘤技术生产的鼠源mAb在体内半衰期短，因而不能用于体内研究。而EB病毒转化、噬菌体展示等传统制备mAb的方法，不稳定、耗时且效率低。随着单细胞逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术的出现，利用巢式PCR从单个B细胞中扩增全长免疫球蛋白(Ig)基因片段可以绕过这些限制，该技术已成为制备新的mAb的通用工具，也是mAb生产中的一个重要进展。在扩增Ig编码基因之前，抗原特异性B细胞用荧光标记的抗原染色，然后分选。
全猪中和抗体通常表现为免疫原性低半衰期长，在体内具有很大的应用潜力。然而，利用线性特异性表位制备抗猪瘟病毒E2蛋白的全猪单克隆抗体尚未见报道。本研究利用荧光表位CTAVSPTTLRTEVVK和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗猪IgG，通过荧光活化细胞分选技术(FACS)分选免疫猪的单个B细胞，从中分离了两株全猪单克隆抗体HK24和HK44。作者分析鉴定出这些mAbs对CSFV表现出显著的中和能力，还证实了这些单抗对CSFV感染的血清学诊断具有重要价值。因此，本研究制备的全猪单抗HK24和HK44具有作为免疫治疗候选物或诊断试剂的潜力。
1.单B细胞分选及mAbs制备。
未免疫猪作为阴性对照组(图1A)，CSFV减毒疫苗免疫猪#3748和#3757表现出高阻断率(图1B)。作者采集#3748猪血液样本，通过流式细胞仪（FACS）利用FITC-抗猪IgG和5-TAMRA-303表位分离单个B细胞。303表位在不同CSFV毒株中高度保守，但在BVDV和BDV毒株中具有高度差异性(图1C)。表位特异性IgG+ B细胞约占细胞总数的0.39% (图1D)。通过巢式PCR从纯化的单个B细胞cDNA中扩增出抗体重链和轻链全长基因，经序列测定，从100个单一表位特异性IgG+B细胞中获得9个抗体序列，可将其分为四组。其中一些抗体具有相同的IgH和IgL基因，并且大多数克隆是IGHV1-4*02和IGKV1-11*01/IGKV2-10*02胚系基因的体细胞变异体(图 1E)，其中HK24和HK44抗体重链基因都有很长的CDR H3，分别由17和21个氨基酸组成。随后，将含有HK24和HK44抗体基因的质粒分别瞬时转染HEK293T细胞，通过SDS-PAGE鉴定(图1F,G)，获得两株单抗HK24和HK44。
2.mAbs HK24和HK44对CSFV E2具有高度的特异性及灵敏性。
为了确定mAbs HK24和HK44与E2蛋白的反应性，作者通过SDS-PAGE试验，证明HK24和HK44能检测到CSFV感染细胞裂解物中55 kDa大小的 E2蛋白，且特异性高，而在未感染细胞裂解物中检测不到(图2A,B)。随后作者原核表达重组E2蛋白(690−866 aa)，通过Western blotting进一步验证了HK24和HK44与重组E2蛋白具有很高的特异性 (图2C,D)。间接ELISA试验显示HK24和HK44与重组E2蛋白呈剂量依赖性结合(图2E)。随后作者通过免疫荧光试验 (IFA) 用HK24和HK44检测PK-15细胞中的CSFV，两抗体的荧光强度为40μg/mL，与CSFV阳性血清处理的样品相同 (图2F)。综上表明，mAbs HK24和HK44对CSFV E2蛋白具有较高的敏感性，可用于CSFV感染的血清学检测。
3.mAbs HK44和HK24 对CSFV E2的结合亲和力评估。
作者用表面等离子体共振（SPR）评价mAbs HK44和HK24与重组蛋白E2的结合能力，用mAb WH303作为阳性对照(图3)。SPR剂量依赖性结合实验表明，三株抗体对E2蛋白均表现较高的亲和力，亲和力范围为125~2000 nM。WH303、HK44和HK24与重组E2蛋白的结合速率常数(Ka)分别为7.75×103、1.7×104和5.0 1×104 M−1S−1，平衡解离常数(KD)分别为2.0 6×10−8、1.85×10−7和3.6 7×10−8 M。表明WH303、HK24和HK44对E2蛋白具有较高的特异性亲和力。
4.mAbs HK24和HK44可以与E2蛋白的特定表位结合。
为进一步确定mAbs HK24和HK44E2蛋白的303表位特异性结合，通过IFA试验，将表达HK24和HK44的HEK293T细胞固定，加入FITC-表位303后，均观察到强绿色荧光，而空载体的细胞无绿色荧光 (图4A)。通过FACS进行亲和力分析显示，用FITC-303表位分离到表达HK24和HK44的HEK293T细胞为60.7%和40.8%明显高于阴性对照组(0.128%) (图4B)。直接IFA结果显示，HK24和HK44及从#3748猪中提纯出阳性IgG能有效识别303表位，HK24和HK44不能与E2蛋白的线性无关表位结合，而阳性IgG可以 (图4C)。表位303的竞争结合分析显示，HK24可抑制303表位与HK44的结合，且抑制作用与mAb HK44相似 (图4D)。表明mAbs HK24和HK44对E2蛋白的303表位结合特异性非常相似。
为了更详细地了解mAbs HK24或HK44结合E2蛋白303表位的特定氨基酸位点，根据虚拟丙氨酸突变扫描(VAMS)结果设计了两个突变位点S832A和E839A，命名为表位303mut1。对于E2−HK44复合物，E2蛋白的突变导致复合物的突变能超过0.5 kcal/mol，表明形成了一个不稳定的蛋白质复合物。而对于E2−HK24复合体，同样的E2突变导致突变能降低，其值<0.5 kcal/mol，表明形成了更稳定的蛋白质复合体。此外，突变体P833A和T834A对两复合物都产生了较高的突变能量，表明P833和T834是两株单抗与E2蛋白结合的关键残基，为了验证VAMS结果，将这两个氨基酸替换为丙氨酸，并命名为表位303mut2。荧光强度显示，HK24与303mut1结合，但与303mut2结合较弱，表明P833和T834是HK24与表位303结合所必需的(图4E)。HK44与303mut1或303mut2的结合非常轻微，表明S832、E839、P833和T834是HK44与表位303结合所必需的(图4F)。这些实验结果与VAMS的预测结果一致。
已有研究报道，mAb WH303能识别表位303(TAVSPTTLR)，因此，作者想明确mAbs HK24和HK44与WH303的结合表位是否存在差异。本研究证明mAb WH303均与表位303mut1和303mut2结合，但与表位303mu2结合较弱，表明P833和T834在WH303与表位303的结合中起重要作用(图4G)。随后，合成了缺失TAV氨基酸残基的表位303，命名为ΔTAV303。直接IFA表明，WH303与表位303结合，但与表位Δ303结合较弱，而HK24和HK44可以同时与表位303和303ΔTAV结合(图4H)。表明HK24和HK44与单抗WH303相比，在表位303上具有不同的结合位点(表1)。综上所述，mAbs WH303、HK24和HK44可以高亲和力特异性识别表位303，但它们结合的氨基酸残基不同。
5.mAbs HK24和HK44在体外可显著中和CSFV。
作者用间接IFA评价了mAbs HK24和HK44对感染CSFV的PK-15细胞的保护作用。HK24和HK44对CSFV有较强的中和活性，在75 μg/mL浓度下未观察到荧光，在浓度为1.1μg/mL时，仅检测到微弱的荧光信号，与CSFV阳性血清组观察到的值一致，而用CSFV阴性血清处理的细胞检测到强烈的荧光信号，表明CSFV感染没有受到抑制，HEK293T细胞上清液处理组作为阴性对照 (图5A)。此外，作者测定了HK24和HK44的IC50 (图5B)。为了进一步检测WH303、HK24和HK44是否能阻断CSFV感染，作者用特异性引物qRT-PCR分析CSFV RNA在PK-15细胞中的拷贝数(图5C,D,E)，分别用浓度75-1.1 μg/mL的HK44-CSFV或HK24-CSFV和125-6.25 μg/mL的WH303-CSFV复合物处理PK-15细胞，复病毒拷贝数明显低于阴性IgG处理组。综上所述，WH303、HK24和HK44均能显著中和CSFV，在防止CSFV感染靶细胞方面发挥重要作用，但WH303的中和活性低于HK24和HK44。
图1 分离表位特异性抗体。(A)未接种疫苗的猪血清样本阻断率。(B)CSFV减毒疫苗株免疫猪的血清样本的阻断率。(C)四株不同猪瘟病毒E2序列的序列比对。(D)#3748猪外周血中表位特异性IgG+ B细胞的比例。(E)IMGT对已分离的抗体基因的V(D)J片段及生殖系(GL)分配列表。(F)SDS-PAGE分析单抗HK24和HK44的表达。(G)样品用8%聚丙烯酰胺凝胶在非还原条件下分离，考马斯蓝染色。
图2 HK24和HK44与E2蛋白的结合。(A) HK24与CSFV E2蛋白的结合。(B) HK44与CSFV E2蛋白的结合。(C，D)重组猪瘟病毒E2蛋白可被单抗体HK2 4(C)和HK44(D)识别。(E)用ELISA检测HK24和HK44与重组E2的结合。(F) HK24和HK44检测PK-15细胞中的猪瘟病毒。
图3 SPR结合试验。2000、1000、500、250和125 nM的E2蛋白与单抗(A)WH303、(C)HK44和(D)HK24的结合。单抗(B) WH303、(D)HK44和(F)HK24各浓度E2的结合反应。
图4 HK24和HK44与表位303的特异性反应。(A)细胞的荧光显微图像。(B)分析HK24和HK44对303表位的亲和力。(C)通过荧光试验检测抗体对表位303的特异性。(D)竞争试验。(E−G)分别测定单抗HK24、WH303或HK44溶液对表位303、表位303mut1或表位303mut2的结合活性，HK24(E)、HK44(F)和WH303(G)。(H) 分别测定HK24、HK44和WH303对303ΔTAV表位或303表位的结合活性。
图5 HK24和HK44中和猪瘟病毒。(A)通过IFA中和试验检测WH303、HK24和HK44与CSFV的中和反应性。(B)CSFV抑制率。(C−E)用定量qRT-PCR检测HK24、HK44和WH303的中和活性。
表1单抗WH303、HK24和HK44结合表位303的差异比较
该研究团队建立了一种简便、快速的特异性B细胞分离方法，首次利用特定的线性表位从免疫猪的单个B细胞中分离出针对CSFV E2蛋白的全猪mAb HK24和HK44。通过一系列检测表征了单抗的功能，证明HK24和HK44两株单抗对猪瘟病毒具有较高的敏感性，在病毒感染的检测和治疗方面具有很大的潜力。
Haisi, Dong, Ang, et al. Development ofWhole-Porcine Monoclonal Antibodies with Potent Neutralization Activity againstClassical Swine Fever Virus from Single B Cells[J]. ACS synthetic biology,2019, 8: 989-1000.
指导老师：王战辉
抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展
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