【摘要】
为了提升目标物特异性、降低检测限或引入新功能，对抗体进行工程化改造已成为生物传感器开发中的关键研究方向。尽管目前已有多种基于亲和性原理的生物传感器问世，但在复杂生物样本中实现蛋白质的可逆与连续监测依然面临诸多挑战。本研究引入了定向进化策略，旨在调整高亲和力抗表皮生长因子受体（EGFR）单链抗体片段（scFv）的解离动力学特性，在无标记结合测定中达成连续蛋白质传感检测的目标。通过针对性地改造抗体-抗原结合界面处的四个特定残基，构建一个由突变型scFv组成的文库。随后，利用噬菌体展示技术结合高通量筛选方法，经过一轮筛选后成功分离出具有快速响应动力学特征的突变体。实验结果显示，与野生型抗体相比，该方法能够在不影响整体亲和力和特异性的前提下，显著提高解离速率约30倍，这主要是通过靶向参与相互作用的paratope实现的。在改良后的无标记结合试验中，获得的突变体scFv片段展示了其在连续监测模式下对不同抗原浓度变化的敏感性，达到了较低的纳摩尔级检测限（KD = 8.39 nM）。此外，通过向scFv中引入一种极性依赖性的荧光染料，并依据荧光波长偏移来读取EGFR的结合状态，进一步验证了以上结论。这一系列的研究成果不仅为生物传感器的设计提供了新的思路，同时也为后续相关领域的深入研究奠定了基础。
【引言】
在现代医学中，实时监测体液中蛋白质生物标志物对于病情可能迅速恶化的患者尤为重要。此类患者包括需要个性化药物监测的群体以及面临高风险并发症（如脓毒症和心肌梗死）的患者。尽管近年来新型生物传感器的发展显著推进了体外及体内连续检测生物标志物的能力，但目前的技术仍然主要集中在小分子化合物的监测上，对于蛋白质生物标志物的连续检测尚显不足。
Plaxco等人近期展示了利用DNA适配体进行体内药物药代动力学监测的潜力，体现了基于可逆结合机制生物传感器的应用前景。然而，用于连续蛋白质检测的可逆适配体相关研究却相对较少。抗体作为一种高度特异性的分子工具，在生物传感领域有着广泛应用；然而，其用于连续蛋白质监测的潜力尚未被充分开发。这主要是由于传统抗体设计存在以下局限性：（1）抗体生成过程耗时且效率较低；（2）少数抗体具有快速解离特征且难以通过传统免疫动物方式获得，限制了其在连续监测中的应用；（3）抗体的二价性可能导致非特异性多重相互作用，从而影响监测精度。
为克服这些技术障碍，该研究团队对抗体结合部位进行了精细工程化设计，旨在开发出能够在稀释血清中实现可逆结合的抗体片段。通过对抗体可变区重链（VH-CDR2）内的关键结合区域进行优化，并构建突变片段库，结合噬菌体展示技术和高通量筛选，最终分离出了解离速率比野生型快30倍的突变体。这些突变体不仅保留了原始抗体对目标抗原的高特异性，而且在含有10%血清的复杂环境中展现了稳定的结合性能，为蛋白质连续监测传感器提供了新的可能性。
该研究表明，通过理性设计和工程化改造，可将高亲和力抗体改造为适用于连续动态监测的试剂。这一成果不仅为实时监测蛋白质生物标志物开辟了创新途径，也为个性化药物治疗和高风险患者的精准管理提供了全新的解决方案。
【内容介绍】
1 结构分析与数据库建设
为了选择性地削弱抗体-抗原复合物的稳定性，该研究基于已发表的帕尼单抗F(ab)2片段与其抗原复合物的晶体结构，针对单个互补决定区（CDR）选择性置换了以下四种残基：Tyr-52、Ser-54、Asn-56和Thr-57（图1）。其中Tyr-52 和 Ser-54 似乎对表皮生长因子受体表位的识别特别重要，它们的conservation scores分别为 80% 和66％（表1）
图1 panitumumab-EGFR复合物的晶体高分辨率结构
（a） VH链和VL链分别用蓝色和绿色表示，EGFR外结构域3用红色表示。
（b） Tyr52，Ser-54，Asn-56和Thr-57为VH-CDR2旁链中的四个残基。
表1 野生型 scFv 序列和VH-CDR2区域中各种残基的出现概率
利用退化引物对由此产生的由四个残基组成的副位点进行排列，生成了一个显示一系列不同偏离率的scFv突变体库。四个位置上21个可能的替换组合产生了一个具有1.16 × 105 个不同克隆的文库，使用TG1 菌株转化，估算文库规模为1.03 × 108 cfu，随机检测显示文库的存活率约为70-80％。
2 噬菌体展示生物筛选
为了富集能够特异性识别表皮生长因子受体（EGFR）抗原的突变scFv库克隆，研究人员采用了噬菌体展示技术作为初步筛选手段。在实验设计中，实施了单轮淘洗，并通过设定三种不同的洗脱条件（pH值分别为2.5、4和5.3），以评估分离结合噬菌体与固定化EGFR抗原的能力（见图2a）。结果显示，在这三种不同pH值条件下，各洗脱池的相对结合强度并无显著差异。进一步分析表明，尽管三个经过扩增的洗脱池在噬菌体被稀释至10⁻³时均能产生稳健的信号，但只有未稀释的噬菌体库样品在与EGFR抗原孵育后表现出明显高于背景基线的信号（见图2b）。这一现象说明，生物淘选过程对于有效去除库中的大量非特异性结合物起到了至关重要的作用。
研究人员从三种洗脱池中随机挑选了90个个体克隆进行分析，并通过ELISA方法测定了它们对阳性抗原（EGFR-His）和阴性对照抗原（白细胞介素22-His）的结合活性（见图3）。由于各洗脱池之间的结果差异不大，且考虑到后续实验资源的限制，研究团队最终决定专注于来自pH 2.5和pH 5.3条件下的结合体进行更深入的研究。经过筛选，共有53个噬菌体克隆被纯化出来，对于这些克隆，研究人员测定了每个样品的滴度。其中，单克隆噬菌体的ELISA信号强度至少达到了野生型（WT）衍生克隆信号的10%，表明这些克隆具有一定的结合活性。为了进一步评估这些克隆的相对亲和力，使用固定数量（5×10⁸ cfu/孔）的纯化噬菌体进行了比较免疫测定（见图2c），以确保实验条件的一致性和结果的可靠性。此外，纯化的噬菌体还被用于将噬菌粒转导至大肠杆菌-HB2151中。
图2 噬菌体展示生物平移实验的酶联免疫分析
图3 克隆对阳性和阴性抗原的识别能力
ab来着pH为2.5的洗脱池，cd来着pH为5.3的洗脱池
3 通过生物层干涉测量法（BLI）筛选克隆库的结合动力学
为了筛选出解离速率较快的克隆体，研究人员首先通过生物层干涉测量（BLI）技术对纯化的53个克隆样本进行了评估。实验结果显示，大多数突变体的表达水平与野生型（WT）片段基本保持一致（见图4）。经过多轮检测条件优化后，使用浓度为31 nM的分析物探针来探测传感器上捕获的抗体片段，最终记录了29个片段及WT片段的表观动力学速率常数和平衡解离常数（详见表1）。为进一步确定具有快速解离特性的克隆，研究团队采用了表面等离子体共振（SPR）技术进行高通量筛选。基于SPR技术的深入分析，共识别出了6个突变体克隆，这些克隆表现出接近或高于10⁻² s⁻¹的表观解离率（见图5）。
图4 阳性噬菌体克隆的点印迹
表1 scFv突变体克隆的ka、kd、KD常数
图5 WT 和六个选定突变片段的示例传感器
4 利用表面等离子共振（SPR）详细分析突变体的结合动力学
为了评估从哺乳动物上清液中纯化的scFv片段的动力学特性，研究人员使用固定化抗聚组氨酸抗体在CM5 Biacore芯片上捕获了这些scFv。实验结果显示，五个突变体（D33、E11、F10、G3 和 H5）表现出与野生型（WT）scFv相似的结合动力学特征（见图6）。然而，E5突变体展现出显著增加的解离率，其解离速度大约是WT片段的30倍，相应的抗体-抗原复合物半衰期约为4.4分钟（t90 = 14.6分钟），这与WT复合物长达126.5分钟的半衰期（t90 = 420.3分钟）形成了鲜明对比（见图7）。上述结果表明，E5突变体适合于连续监测不同浓度分析物的变化，无需中间再生循环即可实现高效的实时检测。为进一步解析E5突变体解离速率显著提高的原因，研究人员利用FoldX力场和程序套件对突变scFv-EGFR复合物结合界面进行了特征分析（见图8）。分析发现，Met-56残基可能是导致E5突变体解离率增加的主要因素，因为它的长疏水侧链直接位于抗体与抗原结合界面之间，可能影响了二者的相互作用稳定性。
图6 WT和五个突变体的结合和解离动力学
图7 （a）29 个 scFv 片段的速率平面图与等亲和力对角线
（b）WT 和六个突变片段的SPR速率平面图
（c）E5 的 SPR 传感器图
图8 WT scFv 和突变 scFv 克隆的结构比较
5 野生型和突变片段的特异性分析
为了验证E5突变体对原始表皮生长因子受体（EGFR）抗原的特异性是否受到影响，研究团队在含有10%血清的条件下进行了ELISA结合实验。实验结果显示，纯化的WT和E5 scFv与EGFR结合时产生的信号均显著高于背景基线，而它们与血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2) 和成纤维细胞生长因子受体 (FGFR) 则没有显示出明显的结合活性。这表明即使在低血清浓度条件下，E5突变体仍能对原始抗原保持高度特异性，并实现可靠且精确的检测。此外，WT和E5片段之间的信号差异与先前通过表面等离子体共振（SPR）技术测量的结果一致，反映了E5突变体整体亲和力相对较低的现象。为了更深入地分析E5片段在此条件下的结合特性，研究人员重复了SPR结合实验，并将EGFR稀释于含10%人血清的检测缓冲液中进行测试（见图9）。对所得传感器图进行全局拟合后发现，无论样品基质复杂性如何，E5的结合率、解离率及总体亲和力参数均表现出一致性。这一结果进一步证实了E5突变体在更为复杂的生物环境中能够以高特异性和适当的亲和力准确识别EGFR。
图9 WT和E5突变片段在血清升高条件下的特异性分析
6 通过SPR进行连续、可逆的分析物监测
为了探究E5突变体在连续分析中的可逆检测潜力，研究团队首先通过聚组氨酸标签将E5和WT片段非共价固定于CM5传感器芯片上，并采用逐步增加后减少EGFR抗原浓度的方式进行实验。由于E5突变体具有较高的解离率常数，在通过His标签捕获到芯片表面后，E5能够准确反映抗原浓度的交替变化（见图10），证明了其在动态浓度监测中的适用性。
随后，为了评估长期稳定性及重复使用能力，研究团队进一步将scFvs共价固定在芯片表面，并在大约11小时的时间跨度内对不同浓度的蛋白质进行了重复监测。结果显示，E5突变体能够稳定可靠地检测低至0.5 nM的EGFR浓度。进一步的研究表明，与非共价固定相比，共价固定方法可以有效消除基线漂移以及因抗-His mAb-scFv复合物解离导致的配体密度下降问题，从而提供更稳定的信号输出。
此外，通过构建SDS浓度梯度的剂量反应曲线，研究发现即使经过三个完整的注射周期，各浓度的数据仍表现出高度的一致性（见图11b）。归一化后的数据集方差系数范围为2.3%-16.1%，这表明实验结果具备良好的再现性和可靠性。同时，在相同1000秒时间窗口内绘制的单个测量周期传感器图显示，传感器响应速度能够稳定且灵敏地反映结合和解离过程中的信号变化（见图11c）。
图10 不同浓度的表皮生长因子受体的连续分析监测图
图11 改进的SPR检测中对不同浓度的表皮生长因子受体的连续分析监测
（a）将E5直接固定在芯片表面，在11小时内对测试范围内不同浓度的分析物（0、0.5、1、2、4 和 8 nM）进行的稳定连续测量
（b）对每个剂量的信号取平均值，构建的结合和解离的剂量反应曲线
（c）注射前基线、结合和解离阶段的第一个测量周期
7 采用替代检测方法进行可逆分析监测
在单周期表面等离子体共振（SPR）实验中，研究团队确定了E5突变体的动力学参数，包括结合速率常数（ka = 1.56 × 10⁵ M⁻¹s⁻¹）、解离速率常数（kd = 1.97 × 10⁻³ s⁻¹），以及平衡解离常数（KD = 1.27 × 10⁻⁸ M）（见图12a）。为了进一步验证E5突变体的可逆性特征，研究人员将其通过C端六聚组氨酸标签固定于NiNTA树脂上，并设计了一系列探针检测实验。具体而言，首先使用高浓度抗原进行探针检测，随后经过5分钟的洗涤步骤以去除未结合的抗原。接着，依次降低分析物浓度进行孵育，并利用350 nm波长激发荧光团，记录发射光谱。在此过程中，以1 μM牛血清白蛋白（BSA）作为阴性对照（见图12b）。通过对比E5片段和WT片段的光谱及曲线，可以发现由于E5片段对EGFR抗原的解离速度较快，在中间洗涤步骤中几乎完全清除了结合的抗原。因此，在抗原浓度逐渐降低时，E5片段表现出的发射光谱蓝移现象显著减少（见图12c、g）。结合SPR和荧光测量的结果，本研究表明E5克隆是一种高效的可逆蛋白质粘合剂，这是首次利用定向进化方法生成的具备快速解离特性的蛋白质粘合剂。
图12 通过光学发射波长偏移对可逆蛋白质结合的测量
【小结】
本研究证明，scFv片段可以通过理性设计展现出适合连续蛋白质生物传感的可逆结合动力学特性。通过对大量候选scFv片段进行高通量表征，研究人员发现了E5，并利用表面等离子体共振（SPR）系统对其进行了连续表皮生长因子受体（EGFR）传感的验证。此外，通过将相同的scFv片段标记上极性荧光染料，进一步证实了EGFR与E5之间的可逆结合特性。
【原文出处】
Christian Fercher, Martina L. Jones, Stephen M. Mahler, and Simon R. Corrie. Recombinant Antibody Engineering Enables Reversible Binding for Continuous Protein Biosensing. ACS Sens. 2021, 6, 764-776. doi: 10.1021/acssensors.0c01510.
原文链接：https://dx.doi.org/10.1021/acssensors.0c01510
指导老师：王战辉
