蛋白质在许多生物反应中起着重要作用。蛋白质的高灵敏检测在许多领域都很重要，例如诊断和治疗药物开发，而且在许多蛋白质差异表达的疾病治疗当中的需求尤为突出。利用高亲和力抗体的多重免疫测定技术提供了高灵敏度同时检测多个蛋白质靶标的潜力，不仅减少了样本量和降低了每次测试的成本，还提供了更多丰富的数据信息，这对于需要多重分析的疾病非常重要。
基于阵列的免疫测定法最早开始于Ekins等人的研究，并在过去30年中进行了积极的探索。在一些免疫分析中，捕获抗体被打印在平坦的表面上，并与样品中的靶分子结合，随后对其进行标记和检测。这种类型的免疫测定可通过将对具有不同蛋白质特异性的捕获抗体固定在平面预定位置上，从而进行多重蛋白质检测。基于阵列用于多重检测的方法之所以吸引人，是因为它是一种容易制造且易于调整并具有用户自定义功能的捕获抗体斑点阵列技术。基于这种方法，已经开发出许多检测方式，包括寡核苷酸扩增，电化学发光（ECL）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。我们已经证明了使用这种基于抗体阵列的测定形式和化学发光检测（称为多重CL ELISA） 的检测范围为亚飞摩尔。
尽管打印抗体阵列已经证明是可行的，但是为了更好的抗体斑点和测定性能仍然需要优化和控制打印抗体技术。一些缺陷限制了抗体打印技术在实验室中的广泛应用，斑点免疫测定用户依赖于预先印制并经过验证的产品，并不支持用户针对其特定要求设计和构建定制的多重免疫测定。
在之前的工作的基础上，开发了一种方法，该方法无需复杂而昂贵的设备，即可轻松定制多重CL ELISA阵列。在这里，我们完成了一个用户可定制的基于阵列的多重免疫分析方法，该方法结合了抗体打印技术与独特的锚定抗体/肽标签对。这项工作实现了可定制的基于阵列的多重免疫测定，能够以渺摩尔灵敏度同时检测人血清和血浆中多达五种不同的分析物。
开发了一种可定制的接触印刷多重免疫分析方法，能够同时测定多达5种具有渺摩尔灵敏度的分析物。此方法在微量滴定板孔底部以圆形图案点样不同的抗体。
与用于ELISA的传统抗体打印不同，该抗体打印使用特定目标靶标的捕获抗体，在此ELISA中，我们在孔表面打印了独特的“锚定”抗体，每个抗体都对特定的肽靶标具有高亲和力。通过将每种肽偶联至独特的分析捕获抗体，这种锚定抗体阵列可实现可定制的接触式印刷多重免疫分析工作流程。开发了一种可测量白介素5（IL-5），白介素6（IL-6），白介素10（IL-10），白介素22（IL-22）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的多重检测方法。
在血清和血浆中，这五种分析物的相关性良好，R2分别为0.99，0.93，0.99，0.96，和0.75。这种方法可用于实验室的可定制多重超灵敏ELISA，而无需使用精密印刷仪器，可用于抗体筛选，定制分析开发，生物标志物检测和用于诊断应用的蛋白质谱分析。
图1 (A)标准夹心ELISA模式。(B)采用锚定抗体和肽标记的改良夹心ELISA(本研究) |
图2 五种不同肽标记IL-6捕获抗体的校准曲线 |
图3 (A)显微镜观察抗体上的光学串扰(B)显微镜下五个抗体点的位置 |
图4 五重直接抗体打印、一重锚定抗体和五重锚定抗体模式的比较 |
图5 (A)六个匹配血清和血浆样本的测量(B)样本中直接打印模式和锚定模式的相关性 |
表1 锚定模式与传统模式检测限比较 |
表2 锚点未占用时，肽标记捕获抗体-锚定抗体交叉反应(1–5列)和分析物/锚点检测交叉反应(第6列) |
表3 锚点占用时，肽-锚定交叉反应(1–5列)和分析物/锚点检测交叉反应(第6列)
表4 一重锚定抗体模式与五重锚定抗体模式检测限的比较
使用可定制的接触式印刷多重抗体阵列ELISA可以同时检测5种分析物并具有渺摩尔的灵敏度。此ELISA利用锚定抗体/多肽对，可对多达五个测定进行多重分析。这五对检测有相近的性能，并且多肽与错误的锚定抗体之间的交叉反应性可以忽略不计，为0.006％。锚定抗体/肽对选择过程，印刷斑点空间分布以及交叉反应的表征使得可定制的多重检测方法得到发展。定制的5重细胞因子测定法测量了人血清和血浆中的IL-5，IL-6，IL-10，IL-22和TNF-α，并且具有良好的相关性，与直接打印抗体的ELISA相比，灵敏度相当。
Tobos C I, Sheehan A J, Duffy D C, et al. ACustomizable Multiplex Antibody Array Immunoassay with AttomolarSensitivities[J]. Analytical Chemistry, 2020.
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.0c00631
指导老师：王战辉
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