-------- 【引语】---------
在酶免疫分析中，酶作为抗原或抗体的标记物，使信号放大及可视化，是免疫分析的重要试剂。本研究将大豆过氧化物酶(SBP)，与最常用的辣根过氧化物酶(HRP)以及碱性磷酸酶(ALP)进行比较，并以莱克多巴胺(RAC)作为模式分子，研究三种酶在ELISA及CLEIA中的应用。结果表明，与抗体偶联后的SBP仍具有耐热、耐酸、耐有机溶剂等优点；SBP能提供高强度且稳定持久的化学发光信号；基于SBP的免疫检测方法在动物尿液样中检测RAC时具有较低的检测限(LOD)和较高的准确性。结果表明SBP有潜力成为HRP和ALP的替代品应用于兽药残留免疫分析。
-------- 【内容介绍】--------
SBP-Ab在不同溶剂环境下的催化活性研究
免疫分析方法的性能通常取决于抗体分子的性能。在实际样本检测时，抗体可能暴露在化学溶剂、不同温度以及酸性或碱性条件下。随着高通量筛选及体外进化等技术的不断发展，获得对溶剂或基质条件具有更强抵抗力的抗体已经成为可能。标记酶作为抗原抗体反应的信号指示分子，也应对不同溶剂环境具有较高的耐受性，才能保证检测结果的准确性。以往研究表明，SBP耐热性能好、pH适用范围宽、有机溶剂耐受性强，然而，在与抗体偶联后，这些优势是否仍然存在尚不清楚。因此本文首先研究了SBP- Ab在不同温度、pH值和有机溶剂浓度下的催化活性变化，并与HRP- Ab和ALP- Ab进行了对比。结果如图1所示，SBP在65℃内保持稳定的催化活性，pH适用范围为3-11，在70%甲醇和45%乙腈中催化活性保持在80%以上，对上述理化因素的耐受性均优于HRP-Ab和ALP-Ab。这些结果表明，SBP的环境适应性强，有一定的潜在应用价值，如复杂基质或极端检测环境等。
图1 在不同温度(A)、pH (B)、甲醇浓度(C)和乙腈浓度(D)处理15 min后，SBP-Ab、HRP-Ab和ALP-Ab的催化活性变化对比图。 |
SBP-Ab催化化学发光的特点
SBP和HRP都能催化鲁米诺-过氧化氢产生化学发光，由于HRP是阳离子酶，会与底物氧化自由基产物相互作用而使酶失活，导致化学发光信号快速衰减，而SBP是阴离子酶，即使在不加任何保护剂的情况下，也不会因为氧化反应产物的作用而失活，因此会在较长时间内保持稳定的化学发光信号。如图2所示，SBP催化鲁米诺-H2O2产生的化学发光信号能在5-10 min内保持稳定，与ALP催化AMPPD产生的化学发光信号变化趋势基本一致，而HRP催化鲁米诺-H2O2产生的化学发光信号在20 s后持续衰减。
图2 SBP-Ab、HRP-Ab和ALP-Ab催化的化学发光信号稳定性比较 |
信号稳定性会直接影响到检测结果的准确性，如图3所示，在加入底物液后30 min内的不同时间点读取化学发光值，建立标准曲线，基于HRP-Ab的icCLEIA在不同时间点的标曲差异较大，IC50值不断上升；而基于ALP-Ab和SBP-Ab的icCLEIA在不同时间点的标曲基本不变，IC50值较为稳定。因此，SBP比HRP更适合应用于化学发光检测体系。
图3 酶促反应时间对基于SBP-Ab、HRP-Ab、ALP-Ab的icCLEIA的影响。A、B、C为添加底物后不同时间点检测到的RAC抑制曲线。D为IC50值随酶促反应时间的变化情况。 |
基于SBP-Ab的icELISA及icCLEIA
将SBP-Ab应用于检测RAC的icELISA，经条件优化后，标准曲线的IC50值为0.27 ng/mL（图4），在猪尿、牛尿及羊尿中的LOD值分别为0.19、0.40、0.06 μg/L（表1），添加回收率为81.0-98.2%，变异系数小于11.6%（表2）；将SBP-Ab应用于检测RAC的icCLEIA，经条件优化后，标准曲线的IC50值为0.06 ng/mL（图4），在猪尿、牛尿及羊尿中的LOD值分别为0.07、0.13、0.03 μg/L（表1），添加回收率为82.6-117.7%，变异系数小于13.8%（表2）。与基于HRP-Ab和ALP-Ab的方法进行比较发现，基于SBP-Ab的方法具有更低的LOD和更高的灵敏度，且在两种方法中的回收率及变异系数均满足兽药残留检测要求。
图4 基于三种酶标抗体的icELISA (A)和icCLEIA (B) 检测RAC的标准曲线。 |
表1. 基于三种酶标抗体的icELISA和icCLEIA在猪尿、牛尿及羊尿中RAC的检测限（LOD） |
表2. 三种尿样中RAC的添加回收率(MRs)及变异系数(CV)(n = 3) |
-------- 【小结】--------
使用SBP代替常用的HRP及ALP，在耐热性能、酸碱适应性、有机溶剂耐受性、信号稳定性、检测灵敏度等多项指标上均有明显优势， SBP很可能会成为HRP及ALP最有竞争力的替代品，在多个领域具有广阔的应用前景。
-------- 【原文出处】--------
Yang, H.; Bever, C. S.; Zhang, H.; Mari, G. M.; Li, H.; Zhang, X.; Guo, L.;Wang, Z.; Luo, P.; Wang, Z., Comparison of soybean peroxidase with horseradishperoxidase and alkaline phosphatase used in immunoassays. AnalyticalBiochemistry 2019, 581, 113336
指导老师：王战辉
编辑校稿：杨玲
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