图示摘要
摘要：赛拉嗪（Xylazine，XYL）为阿片类镇静剂，其滥用、误用与残留危害人类健康。该研究通过理性设计了4种XYL半抗原，获得10株mAbs，并分别建立了基于异源包被半抗原的高灵敏度ic-ELISA与LFIA，可满足用于检测人尿和食品样品中的XYL需求。ic-ELISA的检出限（LOD）为0.10~2.24μg/kg，回收率为83.5%~128.6%,CV<15.8%；LFIA的视觉检出限（vLOD）为0.10~1.80μg/kg，临界值为0.60~4.80μg/kg。此外，研究还探讨了单克隆抗体的分子识别机制。该研究首次为人类尿液和食品样品中XYL的快速筛选提供了有力的工具。
关键词：赛拉嗪；半抗原设计；计算化学；单克隆抗体；免疫分析；生物样本；
【引言】
赛拉嗪（XYL）是α2肾上腺素能受体激动剂，具有镇静、镇痛和肌肉松弛效果。自2000年代起，XYL被滥用为非法阿片类药物掺杂剂，因其强烈效果而被称为“僵尸药物”。近期，XYL本身也被滥用，常掺入饮料中，引发犯罪。作为兽用镇静剂，XYL用于马、牛等动物的麻醉和保定，但非法使用增加了食品安全风险。美国2018至2021年间，XYL相关过量死亡激增1238%，英国和泰国也报告了相关死亡和犯罪。美国和中国未将XYL列为管制药物，但中国最新食品安全标准禁止XYL用于哺乳动物。全球范围内，美国禁止在食品动物中使用XYL，欧盟和联合国粮农组织未设定残留限量。鉴于XYL的滥用，急需开发检测方法以监管XYL在尿液和食品中的残留。
该研究设计四种新型XYL衍生物，通过计算化学验证其合理性，成功制备高亲和力单克隆抗体，并建立敏感的ic-ELISA和LFIA方法，可有效检测人尿液、牛奶等多种样本中的XYL，并满足监管要求。
材料与方法详见原文！
【结果与分析】
3.1半抗原设计、合成及其与载体蛋白的偶联
半抗原设计是小分子化合物单克隆抗体制备过程中最为关键之一步。
在这项研究中，作者基于XYL和4-羟基XYL设计了四个新型半抗原（H1-H4），并在XYL的N7和4-羟基XYL的O16位置引入不同接头。同时，评估了两个先前报道的XYL半抗原（H5和H6）。H1和H2在XYL的N7处引入了含线性烷烃链和芳香环的连接子，而H3和H4则在4-羟基甲苯噻嗪的O16处引入了较短的线性烷烃链。研究表明，半抗原设计需在大小、空间构象和电子分布上模仿目标分子，以制备高亲和力抗体。因此，在半抗原合成之前，首先通过计算化学从构象和电子方面评估了所设计的四个半抗原的合理性。
作者首先获得了XYL和6个半抗原的最低能量构象，然后以XYL为模板与这些半抗原叠合。为清楚起见，仅显示了半抗原的骨骼。叠合结果如图2B所示，所有半抗原都可以模拟图2A中以紫色标记的XYL的2,6-二甲基苯，等效原子的RMSD在0.03和0.12之间。然而，由于XYL的尺寸小，接头的引入不可避免地引起了空间构象的变化，并且可以观察到可见角度旋转，尤其是半抗原H1、H2、H5和H6中的噻嗪环。H3和H4与其他4个半抗原相比拥有更多与XYL更相似的空间构象，这可能意味着H3和H4可能诱导更多针对XYL的高亲和力抗体反应。
半抗原设计中，空间构象和电子分布是关键。ESP（电势分布）与小分子电学性质相关，作者通过ESP分析发现，不同半抗原的电子特性各异。H2的ESP集中在较窄范围，而其他半抗原ESP更均匀。H1、H3、H4、H5和H6显示出较强的氢键供体特性，可能更利于诱导高亲和力抗体。此外，分子描述符如MW、MPI、PSA、cLoP和LoP也影响免疫原性。如图2E所示，H2具有最低的MPI和PSA以及最大的cLogP和LogP，这也不同于其他三种亲水性半抗原。构象和电子方面的分析表明，这些半抗原彼此异质，这在理论上有利于开发高灵敏度免疫测定。
通过计算化学对设计的半抗原进行适宜性评价后，该研究分别合成了4个半抗原，并通过质谱鉴定，结果证明半抗原合成成功。BTG、BSA和KLH分别用于与半抗原偶联作为免疫原，与OVA偶联的半抗原作为包被抗原。MALDI-TOF-MS用于表征BSA偶联物的偶联比，分别为18.0、20.4、1.3和0.76。
图2：XYL和6个半抗原的构象和电子特征（A）XYL和6个半抗原的结构、偶联位置和间隔臂用红色标记；（B）XYL和六个半抗原、氮原子、氧原子和硫原子的最低能量构象的分子排列分别用蓝色、红色和黄色标记；（C）六个半抗原的范德华表面上每个ESP范围内的表面积；（D）H1−H6范德华表面上显示的ESP。负ESP区域标记为红色;阳性区用蓝色标记，中性区用白色标记；（E）6个半抗原的分子描述符，包括MW、MPI、PSA、cLogP和LoP。
3.2抗血清特征与赛拉嗪单抗的制备
作者对每个免疫原免疫的小鼠与第二次免疫后采血进行检测，详细评估了抗血清的亲和力（结果见表1）。发现H3和H4的抗血清在高抑制率和低IC50值方面通常优于H1和H2。结果表明，抗血清的滴度和亲和力主要基于偶联比和半抗原的结构。
第三次免疫后，选择对每个半抗原的XYL亲和力最高的小鼠进行细胞融合，最终获得10个个杂交瘤细胞株。与预期相符，所有设计的半抗原都有效地产生了针对XYL的mAb。来自H1、H3和H4的mAb均显示出对XYL的高亲和力和特异性，IC50值低于1ng/mL，而来自H2的mAb具有较高的IC50值，范围为30.1至82.2ng/mL。从半抗原的计算化学评价中，电子分布结果表明，H1、H3、H4、H5和H6是理论上比H2更强的氢键供体，更有利于诱导针对XYL的高亲和力抗体反应。每个半抗原制备的mAb性能与之前的计算化学结果一致，证实了作者半抗原设计的合理性。
表1使用同源包被抗原通过ic-ELISA表征免疫小鼠对每种免疫原的抗血清。
3.3 ic-ELISA的建立与条件优化
与同源包被抗原相比，异源包被抗原可有效提高ic-ELISA的灵敏度。作者使用棋盘ic-ELISA，根据Amax/IC50比率获得10个mAb和包被抗原的最佳配对和稀释比。较高的Amax/IC50比率意味着ic-ELISA的灵敏度更高。总的来说，ic-ELISA中mAb的所有最高Amax/IC50比值都来自异源包被抗原。随后作者评估了8种XYL结构和功能类似物与所有制备的mAb的交叉反应率（CR）。除可乐定的CR值为0.06-3.70%外，所有制备的mAb对8种XYL类似物的CR均可忽略不计（<1%），这意味着本研究中获得的mAb均对XYL具有极好的特异性
为实现XYL的高性能ic-ELISA，作者优化了如离子强度、pH值和有机溶剂等影响免疫分析的物理因素。此类影响因素的Amax/IC50比率图如图3所示。在0.145M的NaCl下获得最高的Amax/IC50，并且证明偏离0.145M对ic-ELISA不利（图3A）。最后作者选择在pH值为6.89的0.01M PBS缓冲液中加入0.145M NaCl为最佳条件进行后续ic-ELISA试验。优化结果还表明，为达到稳定目的，在生物样品预处理过程中应避免使用乙腈。
基于优化条件，通过ic-ELISA测定XYL的系列浓度）。标准曲线展示了所开发ic-ELISA的灵敏度，XYL的IC50为0.23ng/mL，其在PBS缓冲液中的LOD为0.05ng/mL（图4A）。
图3ic-ELISA理化参数的优化。（A）离子强度、（B）pH、（C）甲醇和（D）乙腈对icELISA的影响（n=3）。图4基于mAb7H5的icELISA对不同样品中XYL的标准曲线。（A）PBS缓冲液中XYL的ic-ELISA标准曲线，（B）PBS和PBS稀释的天然牛奶样品中XYL的ic-ELISA标准曲线，（C）橙汁饮料样品，（D）啤酒样品，（E）碳酸饮料样品，（F）人尿液样品。（n=3）的URL中。
图4基于mAb7H5的ic-ELISA对不同样品中XYL的标准曲线。（A）PBS缓冲液中XYL的ic-ELISA标准曲线，（B）PBS和PBS稀释的天然牛奶样品中XYL的ic-ELISA标准曲线，（C）橙汁饮料样品，（D）啤酒样品，（E）碳酸饮料样品，（F）人尿液样品。（n=3）的URL中。
3.4基质效应与方法回收率验证
详见原文
3.5 LFIA在真实生物样本中的性能验证
详见原文
3.6单克隆抗体对赛拉嗪的分子识别机制
为阐明不同半抗原的mAb与XYL的亲和力差异，作者选择mAb7H5（来自H1）、mAb8B7（来自H2）、mAb13E8（来自H3）和mAb8G9（来自H4）在轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）测序后与XYL进行同源建模和分子对接。4株mAb的同源建模3D构象如图6所示。
如图6所示，XYL在不同单克隆抗体（mAb）的结合腔中呈现不同姿态，导致不同的相互作用力。在7H5Fv-XYL中，XYL位于开放结合腔，与VAL114、PHE116、HIS307、TYR312和TYR313形成疏水作用力，GLY31和SER108与XYL形成氢键，可能是7H5高亲和力的原因。8B7Fv-XYL中，XYL构象扭曲，导致与XYL相互作用的氨基酸残基数减少，可能是8B7亲和力较低的原因。
相比之下，13E8和8G9的结合腔大，与XYL形成多样疏水和氢键作用，展现高亲和力。13E8的结合腔含VAL42、TRP107等八氨基酸残基，8G9则通过TYR38、TRP107等形成疏水作用，GLN307形成氢键。结合腔大小和形状显著影响mAb与XYL亲和力。H1、H3和H4设计的更强氢键供体特性使制备的mAb亲和力优于H2。7H5因形成两个氢键而亲和力最佳；13E8和8G9因一个氢键和疏水作用次之；8B7因疏水作用弱而亲和力最差。以上结果解释了不同半抗原对mAb来源的识别机制以及抗原-抗体相互作用的形成和数量。此外，对接结果再次证明了半抗原预测的合理性。
图6mAb和XYL分子对接。（A）单克隆抗体7H5和XYL，（B）单克隆蛋白8B7和XYL，（C）单克隆蛋白13E8和XYL，（D）单克隆蛋白8G9和XYL。显示了Fv的结构和XYL在结合腔中的姿势、结合腔的疏水表面以及与mAb关键氨基酸的相互作用力。轻链标记为红色，重链标记为蓝色。VLCDR1（VL1）、小麦（VL2）、橙色（VL3）和绿色VHCDR1（VH1）、青色（VH2）和黄色（VH3）的CDR环显示为紫色。结合腔的疏水区域用棕色标记，中性区用白色标记，亲水区域用蓝色标记。标记了与结合腔中的XYL相互作用的关键氨基酸。氢键和疏水相互作用分别标记为绿色和紫色虚线。
【结论】
在该研究中，作者设计了4个具有异源结构的新型XYL半抗原，并通过计算化学证明了半抗原设计策略的合理性。之后，获得10株mAbs，mAb7H5在异源包被抗原下表现出最高的亲和力，且对其他8个类似物交叉反应性可以忽略。并基于优异的mAb7H5，建立了高灵敏度的ic-ELISA和LFIA，可用于一系列生物样品中的XYL滥用监测和残留检测。最后，作者阐明了源自设计的四个半抗原的mAb的分子识别机制。该研究为快速、灵敏且特异地监测人尿液和食品样品中的XYL提供技术支持。
未尽之处详见原文！
原文出处：Luo, L. et al. Food Chemistry. Rational hapten design, antibody preparation, and immunoassay development for rapid screening xylazine in biological samples, 2024, 465, 142054.
指导教师：王战辉教授
